重組釀酒酵母生物合成菜油甾醇

周武林，高惠芳，吳玉玲，張顯，徐美娟，楊套偉，邵明龍，饒志明

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122）

引 言

近年來，甾體藥物因具備良好的抗炎、抗過敏和避孕等作用而備受生物醫(yī)藥行業(yè)的高度重視[1]。菜油甾醇是甾體藥物（孕酮、雄烯二酮、氫化可的松等）的一種重要合成前體，也是植物來源的主要甾醇之一[1-2]。其與動(dòng)物來源的主要甾醇（膽固醇）的結(jié)構(gòu)僅在C24位多出一個(gè)甲基，與微生物來源的主要甾醇（麥角甾醇）的區(qū)別在于C7～8和C22～23位是飽和單鍵。因此，這為微生物法生產(chǎn)菜油甾醇提供了可行性的理論基礎(chǔ)[3]。

目前，甾體類藥物主要通過化學(xué)合成和生物催化兩種主要方式進(jìn)行生產(chǎn)[4-7]。由于化學(xué)合成法會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染且中間步驟復(fù)雜，因此，生物催化因其綠色環(huán)保且反應(yīng)過程簡易而受到了極大的關(guān)注[8]。然而，由于甾體類藥物及其中間體水溶性較差，難以進(jìn)出細(xì)胞被利用，造成了生物催化生產(chǎn)甾體類藥物的較低生物轉(zhuǎn)化率。雖然有添加助溶劑以及將底物溶解于有機(jī)溶劑中進(jìn)行添加等方法來提高微生物對(duì)底物的利用率，但轉(zhuǎn)化率仍然不是很高[9-11]。已知酵母細(xì)胞體內(nèi)存在著一條天然的甾醇合成途徑（圖1），因此可作為合成甾體藥物的優(yōu)良底盤細(xì)胞，以通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甾體藥物。其中釀酒酵母作為公認(rèn)的模式安全（GRAS）生物，對(duì)低pH和發(fā)酵抑制劑有很高的耐受性，因此釀酒酵母被認(rèn)為是生產(chǎn)生化試劑的首選底盤細(xì)胞[12]。除此之外，釀酒酵母作為容易操作的真核細(xì)胞生物之一，對(duì)其生理和代謝擁有豐富的知識(shí)以及現(xiàn)有的各種可實(shí)用的基因組遺傳操作系統(tǒng)（如:目前最高效的CRISPR-CAS系統(tǒng)），為釀酒酵母的工程化改造提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[13-15]。研究表明，菜油甾醇可以取代麥角甾醇成為酵母中的主要甾醇，其生物膜活性不受影響[16]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道在釀酒酵母體內(nèi)成功構(gòu)建了氫化可的松，皮質(zhì)酮以及孕酮等多種甾體物質(zhì)的從頭合成[2]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道在解脂耶氏酵母體內(nèi)通過導(dǎo)入外源的7-脫氫膽固醇還原酶DHCR7（7-dehydrocholesterol reductase DHCR7）和敲除C-22甾醇去飽和酶Erg5（C-22 sterol desaturase Erg5），來使麥角固醇的C7～8位以及C22～23位的雙鍵飽和，構(gòu)建了一條菜油甾醇生物合成途徑（圖1）[17-18]。但是，目前酵母體內(nèi)生物合成甾體藥物仍然處于一個(gè)低水平狀態(tài)。

圖1 釀酒酵母體內(nèi)菜油甾醇生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathway of campesterol in Saccharomycescerevisiae

本研究中，首先采取了多樣性酶來源的篩選策略，通過同源性分析和序列比對(duì)，得到了75種不同來源的DHCR7，再從中隨機(jī)挑選了10種來源的DHCR7采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將ERG5基因替換成DHCR7基因來構(gòu)建菜油甾醇合成途徑的同時(shí)解除麥角固醇競爭途徑，進(jìn)而構(gòu)建一條高效的菜油甾醇合成途徑。然后，結(jié)合啟動(dòng)子優(yōu)化以及增加DHCR7表達(dá)盒在基因組中的拷貝數(shù)的方式，提高DHCR7在酵母體內(nèi)的表達(dá)水平以構(gòu)建一株高產(chǎn)菜油甾醇的酵母細(xì)胞。最終采用補(bǔ)料分批發(fā)酵策略，菜油甾醇產(chǎn)量達(dá)到了916.88 mg/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為后續(xù)的甾體類藥物的生物合成提供了一個(gè)很好的平臺(tái)，也為其他化學(xué)藥物的生物合成提供了科學(xué)理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及培養(yǎng)基 本研究使用的所有菌株和質(zhì)粒均列在表1中，大腸桿菌所用的培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB）：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。酵母細(xì)胞的生長培養(yǎng)基為YPD：10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為YPG：10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、20 g/L半乳糖。營養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基為SC-URA。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%的瓊脂粉。5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖。補(bǔ)料培養(yǎng)基：5 g/L酵母膏、10 g/L蛋白胨、400 g/L葡萄糖。

表1 本研究所有菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

續(xù)表1Table 1 continued

1.1.2 基因和引物 本實(shí)驗(yàn)中所使用的DHCR7基因分別來源于Carassius auratus(XP_026124274.1)，Pangasianodonhypophthalmus(XP_026786162.2)，Triplophysa tibetana(KAA0723749.1)，Labeo rohita(RXN17635.1)，Danio rerio(NP_958487.2)，Cyprinus carpio(XP_018972396.1)，Colossomamacropomum(XP_036442229.1)，Astyanaxmexicanus (XP_007254692.2)，Cottoperca gobio(XP_029284590.1)和Xiphophorus maculates(XP_005812111.1)，分別經(jīng)釀酒酵母密碼子優(yōu)化后，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并連接到pET-28a質(zhì)粒中，本實(shí)驗(yàn)中的擴(kuò)增基因整合片段時(shí)所使用的引物序列均由網(wǎng)站軟件工具CASDesigner(http://casdesigner.jbei.org)在線生成。所使用的引物如表2所示。

1.1.3 主要試劑 DNA聚合酶、T4DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶購于大連寶生物生物工程有限公司；用于DNA片段純化和質(zhì)粒提取的mini DNA快速純化試劑盒和質(zhì)粒miniprep試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司，Ultrapure RNA Kit超純RNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)。菜油甾醇、膽固醇、麥角固醇以及正己烷均為色譜純購于Sigma公司；其他試劑購自于國藥集團(tuán)。

1.1.4 主要儀器 PCR儀，德國Eppendorf公司；UVP凝膠成像儀，上海天能；核酸電泳系統(tǒng)，北京市六一儀器廠；蛋白電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；賽默飛U3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；恒溫振蕩金屬浴，上海一恒科技有限公司；氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 遺傳操作方法 根據(jù)先前報(bào)道的酵母基因編輯方法，在Cas9蛋白輔助作用下同源重組整合或者敲除指定基因[20]。通過使用CASdesigner生成的引物來PCR擴(kuò)增供體DNA片段，以構(gòu)建一個(gè)整合的表達(dá)盒（通常包含兩個(gè)1 kb側(cè)翼同源區(qū)，啟動(dòng)子，基因序列和終止子），該盒包含靶向所選基因組位點(diǎn)的1 kb側(cè)翼同源區(qū)域，然后與靶向該基因的Cas9-gRNA質(zhì)粒（pCut）共轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞。此外，CASdesigner所設(shè)計(jì)的引物在片段之間會(huì)提供30～60 bp的同源臂，因此，在酵母體1～5個(gè)單獨(dú)的片段可以進(jìn)行同源重組自組裝。靶向基因組基因座的pCut質(zhì)粒是從線性骨架和包含新gRNA序列的線性PCR片段體內(nèi)組裝而成的。新的sgRNA由在線sgRNA設(shè)計(jì)工具（http://yeastriction.tnw.tudelft.nl/#!/）所產(chǎn)生。

1.2.2 釀酒酵母細(xì)胞感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化 釀酒酵母轉(zhuǎn)化根據(jù)先前報(bào)道描述的方法進(jìn)行[20]。將新鮮過夜培養(yǎng)的酵母細(xì)胞接種到2×YPD培養(yǎng)基至OD600為0.2，在30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為1.0。然后，收集5 ml培養(yǎng)液于8000 r/min離心5 min，加入2.5 ml的H2O洗滌兩次。使用含有供體DNA片段（2μg）和pCUT質(zhì)粒（0.25 ng）的50μl水溶液對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸，加入至轉(zhuǎn)化反應(yīng)液（260μl 50%PEG3350、36μl 1 mol/L LiOAc，10μl ssDNA，4μl H2O）中混合。將混合液在42℃溫育40 min，并通過以6000 r/min離心1 min收集沉淀。細(xì)胞沉淀重懸于500μl H2O中，然后取100μl H2O在選擇性瓊脂平板（SC-U）上涂布均勻。通過測(cè)序驗(yàn)證整合的結(jié)果，挑取正確的菌落在消除質(zhì)粒后用于下游實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 產(chǎn)菜油甾醇重組酵母菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 將甘油管中的重組酵母菌在YPD固體平板上劃線活化，生長48 h后。挑取單菌落接入10 ml/50 ml的小瓶液體YPD種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。然后，以2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 ml/250 ml的液體YPD培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下發(fā)酵48 h，接著收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50 ml/250 ml的液體YPG培養(yǎng)基中進(jìn)一步發(fā)酵96 h。收集細(xì)胞，進(jìn)行菜油甾醇的提取與檢測(cè)。

將單菌落接種于10 ml一級(jí)種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，再以5%的接種量接入至100 ml二級(jí)種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，10%的接種量接種于2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中。控制5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵參數(shù)，溫度、pH、通氣量及攪拌速率分別控制在30℃、5.5、2 m3/(m3·min)和500 r/min。監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中殘?zhí)橇浚囵B(yǎng)基中葡萄糖消耗完畢，開始補(bǔ)加半乳糖，待半乳糖快消耗完時(shí)立即補(bǔ)加至40 g/L，直至發(fā)酵結(jié)束。葡萄糖含量用生物傳感分析儀SBA-40E進(jìn)行測(cè)定，半乳糖含量用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)：視差檢測(cè)器RID，色譜柱為氰柱，柱溫80℃，流動(dòng)相為超純水，流速0.6 ml/min，檢測(cè)溫度55℃。

1.2.4 菜油甾醇的提取與檢測(cè) 取1 ml菌液離心收集細(xì)胞，加入2 ml皂化反應(yīng)液（20%KOH-50%C2H5OH）且加入100μl 1 g/L膽固醇作為內(nèi)標(biāo)，置于85℃溫浴2 h。待反應(yīng)結(jié)束后，加入6 ml正己烷充分振蕩萃取，取上層萃取液于氮吹儀中用氮?dú)獯蹈桑尤? ml色譜級(jí)甲醇復(fù)溶。經(jīng)0.22μm膜過濾后，通過ThermoFisher HPLC分析，色譜柱為Diamonsil C18，5μm，250 mm×4.6 mm，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。在205 nm處檢測(cè)到菜油甾醇和膽固醇，流動(dòng)相純甲醇組成；流速為1 ml/min，柱溫為30℃。

1.2.5 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 取1 ml菌液離心收集細(xì)胞，加入600μl山梨醇緩沖液（以0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液配制1.2 mol/L山梨醇溶液）并加入10μl蝸牛酶，進(jìn)行30℃破壁處理30 min。然后再根據(jù)相應(yīng)的RNA提取試劑盒（CW2581s）提取酵母RNA。將已提取好的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將cDNA的濃度稀釋至20 ng/μl作為模板，利用SYBR?Green I試劑進(jìn)行Real Time PCR，內(nèi)參基因選擇ACT1。RT-qPCR所用引物如表2所示。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 菜油甾醇生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

2.1.1 脫氫膽固醇還原酶DHCR7生物多樣性分析DHCR7作為菜油甾醇合成途徑的關(guān)鍵酶，可還原于麥角甾-5,7-二烯醇的C7～8位的雙鍵生成菜油甾醇。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)來自Methylomicrobium alcaliphilum20Z的同源蛋白Δ14-甾醇還原酶（MaSR1，PDB登錄號(hào)4quv）的晶體結(jié)構(gòu)，建立了Human，Rallus norvegicus和Oryza saliva等多種來源的DHCR7的結(jié)構(gòu)模型[17,21]。DHCR7包含十個(gè)螺旋，其中九個(gè)（1～9螺旋）據(jù)報(bào)道是跨膜片段[22],在MaSR1和DHCR7兩種蛋白與NADPH結(jié)合的殘基是完全保守，基于該模型可知，DHCR7的第6～10個(gè)螺旋分別包裹了兩個(gè)相互連接的口袋，被認(rèn)為是用于NADPH和疏水性甾醇底物的結(jié)合[17,23]。

酵母細(xì)胞體內(nèi)構(gòu)建異源途徑時(shí)，從多樣性來源篩選高效酶是提高異源途徑生產(chǎn)力的有效策略。據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，來自D.rerio的DHCR7已被證明是目前最高效的菜油甾醇作用酶[18]。在本研究中，為了能夠進(jìn)一步篩選出更加高效的作用酶，以DrDHCR7為基礎(chǔ)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及同源性比對(duì)（圖2）[24]。發(fā)現(xiàn)DrDHCR7與來源于C.auratus等75種物種中的DHCR7高度同源，同源性高達(dá)78.83%～93.10%。因此，本研究從中選擇了C.auratus（同源性92.68%），C.carpio（同源性93.10%），T.tibetana（同源性91.37%），L.rohita（同源性92.26%），P.hypophthalmus（同源性82.64%），C.macropomum（同源性86.40%），A.mexicanus（同源性85.77%），C.gobio（同源性80.71%），X.maculatus（同源性79.87%）9種不同物種來源的DHCR7進(jìn)行本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以期篩選出最佳的DHCR7用以構(gòu)建高效菜油甾醇生產(chǎn)菌株。

圖2 多樣性來源的DHCR7進(jìn)化樹Fig.2 DHCR7 evolutionary tree fromdiverse sources

2.1.2 菜油甾醇合成途徑的構(gòu)建 在酵母細(xì)胞整個(gè)甾醇的合成途徑中，角鯊烯是極為重要的前體物質(zhì)（圖1），對(duì)后續(xù)甾醇物質(zhì)的合成起著至關(guān)重要的作用[25-26]。因此，在本研究中，選擇了角鯊烯高產(chǎn)菌株GTy23作為本實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株，由先前文獻(xiàn)所報(bào)道該菌株是S.cerevisiaeBY4742經(jīng)基因改造所獲得的，該菌株提供了豐富的角鯊烯前體，這也為菜油甾醇的高水平合成提供了良好的前提條件[19]。在酵母體內(nèi)，內(nèi)源麥角固醇合成途徑是外源菜油甾醇合成途徑的競爭分支途徑（圖1），為了減少分支途徑的競爭，本研究采用了CRISPR/Cas9技術(shù)，將S.cerevisiae內(nèi)源ERG5基因替換成不同來源的DHCR7基因[圖3(a)]，最終構(gòu)建得到整合有不同來源DHCR7的菜油甾醇生產(chǎn)菌株。經(jīng)YPD搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，結(jié)果如圖3(b)所示，含有PhDHCR7的菌株Zw507表現(xiàn)出了最高的菜油甾醇的產(chǎn)量216.93 mg/L，比菌株Zw503（整合了DrDHCR7）的產(chǎn)量167.91 mg/L提高了29.2%（**p≤0.01）。另外，菌株Zw506（整合了CmDHCR7）和Zw509（整合了LrDHCR7）也表現(xiàn)出了較高的菜油甾醇產(chǎn)量，但相比于菌株Zw507仍然存在很大的差距，因此，菌株Zw507被選擇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作的起始菌株。

圖3 重組菌株的構(gòu)建（a）以及不同物種來源的DHCR7菜油甾醇產(chǎn)量（b）(**與對(duì)照菌株比較p≤0.01；由t檢驗(yàn)確定，下同)Fig.3 The construction of recombinant strains(a)and the production of DHCR7 campesterol from different species(b)(**p≤0.01 compared with the control strain;as determined by t test.The same below)

2.2 酵母細(xì)胞體內(nèi)DHCR7表達(dá)水平的優(yōu)化

2.2.1 通過篩選不同啟動(dòng)子來增加菜油甾醇的產(chǎn)量 在異源基因表達(dá)過程中，啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要組成部分，其活性會(huì)顯著影響異源基因轉(zhuǎn)錄的起始、持續(xù)時(shí)間和表達(dá)程度，從而影響外源基因在宿主中的轉(zhuǎn)錄效率，同時(shí)對(duì)細(xì)胞中mRNA的總體豐度和蛋白質(zhì)含量起著決定性作用，最終影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成[27]。為了能夠精準(zhǔn)調(diào)控DHCR7的相對(duì)表達(dá)水平以進(jìn)一步提高菜油甾醇的合成水平，本研究篩選了10種啟動(dòng)強(qiáng)度較強(qiáng)的酵母內(nèi)源性啟動(dòng)子（PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p）與DHCR7基因進(jìn)行組合[圖4(a)][28-30]。通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)原始啟動(dòng)子GAL1p控制下的DHCR7表現(xiàn)出相對(duì)較高的轉(zhuǎn)錄水平，但在TEF1p啟動(dòng)子控制下表現(xiàn)出了最高的轉(zhuǎn)錄水平，比GAL1p啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)錄水平提高了1.21倍（**p<0.01），是TDH2p啟動(dòng)子和GPD1p啟動(dòng)子控制下表達(dá)水平的14.7倍和6.42倍[圖4(b)]。搖瓶發(fā)酵檢測(cè)，DHCR7的轉(zhuǎn)錄水平與菜油甾醇的產(chǎn)量大體趨勢(shì)一致，菌株Zw514（TEF1p啟動(dòng)子控制的PhDHCR7基因）的菜油甾醇產(chǎn)量能夠達(dá)到253.35 mg/L，比對(duì)照菌株Zw507（GAL1p啟動(dòng)子控制的PhDHCR7基因）的產(chǎn)量高出了16.8%（**p<0.01）[圖4(c)]。此外，比菌株Zw520（TDH2p啟動(dòng)子控制的PhDHCR7基因）和菌株Zw519（GPD1p啟動(dòng)子控制的PhDHCR7基因）的菜油甾醇產(chǎn)量分別高出了400.13%和322.2%。因此，菌株Zw514被選擇來進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。

圖4 不同啟動(dòng)子與PhDHCR7基因組合的示意圖（a）、PhDHCR7表達(dá)量（b）以及菜油甾醇產(chǎn)量(c)Fig.4 Schematic diagram(a),PhDHCR7 expression(b)and campesterol production(c)of combinations of different promoters and DHCR7 genes(**p<0.01)

2.2.2 增加DHCR7在酵母基因組上的拷貝數(shù)來提高菜油甾醇的產(chǎn)量 據(jù)上述結(jié)果分析，菜油甾醇的產(chǎn)量與PhDHCR7表達(dá)量大致呈正比，因此，猜想PhDHCR7的表達(dá)量可能是菜油甾醇高產(chǎn)的一個(gè)限制性因素。為了進(jìn)一步提高其表達(dá)量，本研究通過圖5（a）所示的方法來增加PhDHCR7表達(dá)盒在酵母基因組中的拷貝數(shù)，進(jìn)而提高菜油甾醇的產(chǎn)量。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示[圖5(b)]，隨著PhDHCR7表達(dá)盒的拷貝數(shù)增加，菜油甾醇的產(chǎn)量也在逐漸提高，但當(dāng)拷貝數(shù)增加至3個(gè)拷貝時(shí)，菌株Zw523達(dá)到了最高的菜油甾醇產(chǎn)量302.27 mg/L，比菌株Zw514的產(chǎn)量提高了19.31%（**p<0.01），且再增加其拷貝數(shù)也對(duì)菜油甾醇的產(chǎn)量并無影響。同時(shí)，雖然PhDHCR7表達(dá)盒拷貝數(shù)不斷地增加，但這并沒有對(duì)細(xì)胞造成顯著傷害。因此，PhDHCR7的過表達(dá)并未對(duì)酵母細(xì)胞造成過重的負(fù)擔(dān)，限制菜油甾醇產(chǎn)生的很大可能因素是中間前體供應(yīng)不足。雖然所選的出發(fā)菌株能夠高產(chǎn)角鯊烯，但是甾醇后期合成途徑中反應(yīng)酶共計(jì)13個(gè)[31-32]，一方面由于中間部分酶屬于限速酶（如ERG1、ERG6和ERG11等）導(dǎo)致部分甾醇中間體積累不足[33-35]；另一方面，釀酒酵母體內(nèi)甾醇后期合成途徑中存在其他的競爭分支途徑也會(huì)消耗部分中間體[31]。因此，選擇了菌株Zw523進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化。

圖5 PhDHCR7表達(dá)盒的多重拷貝數(shù)菌株的示意圖（a）以及菜油甾醇產(chǎn)量（b）Fig.5 Schematic diagram(a)and campesterol production(b)of the multiple copy number strain of PhDHCR7 expression cassette(**p<0.01,*p<0.05)

2.3 重組釀酒酵母菌株的高密度發(fā)酵

本研究中，通過代謝工程手段構(gòu)建了高產(chǎn)菜油甾醇的重組菌株Zw523，該菌株比原始生產(chǎn)菌株Zw503的菜油甾醇產(chǎn)量提高了80.02%。為了進(jìn)一步提高菜油甾醇的產(chǎn)量，本研究在5 L生物反應(yīng)器中，根據(jù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的策略對(duì)菌株Zw523進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵。Zw523菌株的發(fā)酵分為兩個(gè)階段，在第一階段以葡萄糖作為生長碳源。初始的葡萄糖濃度為50 g/L，在發(fā)酵30 h后，葡萄糖幾乎被消耗完全。此時(shí)，開始進(jìn)入第二階段，由于葡萄糖可以抑制半乳糖的誘導(dǎo)，因此在葡萄糖耗盡后添加半乳糖以誘導(dǎo)Zw523菌株中MVA途徑中內(nèi)源酶的高表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)菜油甾醇高效合成。在30 h后，開始往發(fā)酵罐中投加半乳糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，并當(dāng)半乳糖快消耗完時(shí)不斷補(bǔ)加半乳糖，持續(xù)發(fā)酵144 h，最終菜油甾醇的產(chǎn)量達(dá)到了916.88 mg/L（圖6），其生產(chǎn)強(qiáng)度為6.37 mg/(L·h)。

圖6 重組釀酒酵母Zw523的補(bǔ)料分批發(fā)酵Fig.6 Fed-batch fermentation of recombinant Saccharomyces cerevisiae Zw523

3 結(jié) 論

本研究中，通過生物信息學(xué)分析及同源性比對(duì)，獲得了75種不同來源的DHCR7，并從中隨機(jī)篩選了10種不同物種來源的DHCR7。利用CRISPR/Cas9技術(shù)將內(nèi)源ERG5基因替換成多種來源的DHCR7基因，敲除內(nèi)源麥角固醇分支合成途徑，成功構(gòu)建了高效的菜油甾醇合成途徑。通過搖瓶發(fā)酵，篩選出了最佳物種來源P.hypophthalmus的DHCR7。菌株Zw507達(dá)到了216.93 mg/L的菜油甾醇產(chǎn)量，比目前文獻(xiàn)中所報(bào)道的攜帶Danio reriol來源DHCR7的菜油甾醇生產(chǎn)菌株Zw503的產(chǎn)量提高了29.2%。ⅩⅢ

然后，為了提高DHCR7在酵母細(xì)胞中的表達(dá)水平，選擇了10種酵母內(nèi)源性啟動(dòng)強(qiáng)度較強(qiáng)的啟動(dòng)子來組合PhDHCR7。通過搖瓶發(fā)酵以及熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子TEF1p表現(xiàn)出最強(qiáng)的啟動(dòng)能力，菌株Zw514能夠達(dá)到最高的菜油甾醇產(chǎn)量253.35 mg/L。為了進(jìn)一步提高DHCR7在酵母體內(nèi)的表達(dá)水平以提高菜油甾醇的產(chǎn)量，本研究增加了DHCR7基因表達(dá)盒的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，當(dāng)拷貝數(shù)增加至3時(shí)，菌株Zw523達(dá)到最高的菜油甾醇產(chǎn)量302.27 mg/L。最終，通過5L發(fā)酵罐對(duì)重組菌株Zw523進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，菜油甾醇的產(chǎn)量達(dá)到了916.88 mg/L，其生產(chǎn)強(qiáng)度為6.37 mg/(L·h)。

本研究成功構(gòu)建了一株高產(chǎn)菜油甾醇的釀酒酵母重組菌株，該菌株可作為后續(xù)的其他甾體藥物（孕烯醇酮、孕酮、氫化可的松）生物合成的底盤細(xì)胞。同時(shí)，本研究也為其他化學(xué)藥物的生物合成提供了理論指導(dǎo)。