鹽酸克倫特羅檢測方法的建立及應用

李志娟，李洪政＊，付 坤，閻永斌，王永生

（1.河南國康檢測技術有限公司，河南 鄭州 450003；2.河南中德檢測技術有限公司；3.河南農(nóng)業(yè)大學禽病研究所）

鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB），俗稱“瘦肉精”，是一類β-腎上腺素受體激動劑化學物質(zhì)的總稱，該物質(zhì)為白色或類白色的結晶體粉末，味苦，熔點為161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。當瘦肉精進入機體后，導致心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)運行出現(xiàn)障礙，引起多種心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。動物源性食品中瘦肉精是我國明令禁止的違禁藥品。因此，需要加強動物性食品中的瘦肉精的檢測，及時發(fā)現(xiàn)不合格的肉及肉制品，保障食品安全，對鹽酸克倫特羅的有效檢測和監(jiān)控刻不容緩。

目前對鹽酸克倫特羅的檢測方法有感官檢驗法、酸堿度法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、膠體金快速檢測卡（DIGFA）、毛細管電泳法（EC）、高效液相法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、金磁納米粒子高靈敏定量（MGNPs）、中空纖維膜三相液相微萃取法（HF-LLLME）、光聲光譜法（PS）、液相芯片技術（LC-chip）等方法，其中朱小艾等采用高效液相色譜法對鹽酸克倫特羅的前處理和上機條件進行優(yōu)化，但與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）相比，液質(zhì)方法耗時更短，定量更準確。俞慧紅采用GC-MS的檢測方法，但其前處理過程需要通過提取-反萃取-凈化-柱后衍生的方式進行，耗時較長。（原）農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》采用了液質(zhì)的方法，但其前處理過程采用酶解較為復雜。故該研究擬在前人研究的基礎上，對樣品的前處理過程和上機條件進行優(yōu)化，旨在為鹽酸克倫特羅的檢測提供一種簡便、快速、準確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 豬肉、牛肉、羊肉 均采購自菜市場。

1.1.2 鹽酸克倫特羅標準品 純度大于98.0%，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司。

1.1.3 乙酸乙酯、氨水、碳酸鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.4 甲醇、甲酸、乙腈 色譜純，sigma。

1.2 主要儀器與設備

1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源） 美國Waters公司W(wǎng)aters TQD。

1.2.2 反向色譜柱 美國WatersUPLCTMBEHC18

（2.1NN 100mm，1.7μm）。

1.2.3 電子天平 BSA2202S-CW，感量0.01g，賽多利斯。

1.2.4 分析天平 BT125D，感量0.00001g，賽多利斯。

1.2.5 氮吹儀 WD1000，杭州瑞誠儀器有限公司。

1.2.6 固相萃取裝置 ASE-12/16/24，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2.7 高速冷凍離心機 熱電ThermoST8ST8R，Thermo Fisher。

1.2.8 恒溫振蕩水浴搖床 MKY-SPH-110X12，麥科儀（北京）科技有限公司。

1.2.9 渦旋混合器 88882010，ThermoFisher。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

5%氨化甲醇溶液：量取5mL氨水，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻即得；0.1%甲酸溶液：量取水100mL，加入0.1mL甲酸，混勻；乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）：量取乙腈5mL，加入0.1%甲酸溶液95mL，混勻；10%碳酸鈉水溶液：稱量10g碳酸鈉，溶于100mL水中，混勻；標準儲備液：稱取鹽酸克倫特羅約10.0mg，置于100mL量瓶內(nèi)，用甲醇溶解并稀釋成濃度為100μg/mL的標準儲備液，-20℃冰箱中保存，有效期6個月。混合標準中間工作液：準確量取鹽酸克倫特羅標準儲備液置100mL量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為20ng/mL的混合標準中間工作液。-20℃冰箱中保存，有效期6個月。

1.3.2 試樣的制備與保存

取適量新鮮的空白樣品和采購的10份豬肉、牛肉、羊肉肌肉部分，分別混勻，-20℃以下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 質(zhì)量控制樣品的制備

空白樣品：取空白試樣，與待測試樣同步處理。添加樣品：取空白試樣2i0.02g，添加20ng/mL的標準中間工作液100μL，制得濃度為1μg/kg的陽性添加試樣，與待測試樣同步處理。

1.3.4 提取

準確稱取2i0.02g供試樣品于50mL離心管內(nèi)，加入10%碳酸鈉水溶液5mL。加10mL乙酸乙酯提取，渦旋震蕩10min，8000r/min離心10min，重復提取一次，合并兩次上清液。向合并的上清液中加入0.1mol/L鹽酸溶液5mL，渦旋混勻，震蕩10min，5000r/min離心5min，重復提取一次，合并兩次水相，備用。

1.3.5 凈化

混合型陽離子交換固相萃取柱依次用甲醇、一級水各3mL活化；取全部備用液過柱；再依次用一級水、甲醇各3 mL淋洗，減壓抽干；用5%氨水甲醇溶液3mL洗脫，洗脫液在50℃下用氮氣吹干，殘余物用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）1.0mL溶解，渦旋混勻，取上清液過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.6 系列標準工作液的制備

準確量取鹽酸克倫特羅標準溶液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）稀釋成濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL的系列標準工作液。

取空白試樣2i0.02g于不同離心管中，按1.3.4、1.3.5步驟操作，制得濃度為0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL的對照溶液。

1.4 儀器參數(shù)與測定

1.4.1 色譜條件優(yōu)化

色譜柱：WatersUPLCTMBEHC18（2.1NN 100mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流動相：A-乙腈；B-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，進樣量：10μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源類型：ESI＋；毛細管電壓：3.0KV；萃取補償電壓：70V；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150L/hr；霧化氣流速：1000L/hr。

1.5 精密度試驗

該研究選取多種空白樣品進行添加回收率和精密度試驗，選取了3種基質(zhì)豬肉、牛肉、羊肉，按1.3.4和1.3.5步驟操作，添加水平分別為0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg，按該文方法進行前處理和測定，平行測定6次。

1.6 方法應用

隨機抽檢動物源性食品10份，采用該文建立的方法測定其中鹽酸克倫特羅的含量，并采用（原）農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008進行復測，進行結果比對。

2 結果與分析

2.1 前處理優(yōu)化結果

該研究采用3種前處理方法處理樣品，每種方法優(yōu)缺點，見表1。

表1 3種樣品前處理方法的比較

2.2 色譜條件優(yōu)化結果

試樣開始采用乙腈-水作為流動相，發(fā)現(xiàn)響應值較低，在水相中加入0.1%甲酸，可促進其離子化，響應值增高，于是采用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相。

2.3 標曲溶液稀釋液的確定

取陰性空白樣，按1.3.4、1.3.5步驟操作，配置一系列基質(zhì)標準溶液，同時用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）配置相同濃度的標準工作溶液，上機測定，用上述兩套標曲處理同一個加標濃度結果顯示，基質(zhì)標曲溶液處理出來的結果是乙腈-0.1%甲酸溶液配置的標曲處理的105%，說明經(jīng)前處理，凈化程度較高，基質(zhì)效應影響較小。在后續(xù)實驗中，可直接采用乙腈-0.1%甲酸溶液配置標曲溶液。

2.4 線性關系、檢出限和定量限結果

該研究采用乙腈-0.1%甲酸配置質(zhì)量濃度0.5～20 ng/mL的鹽酸克倫特羅標準溶液，按優(yōu)化后的液相質(zhì)譜條件進行測定，線性關系良好，線性方程y=429.858x-53.1756（R2=0.999178），采用標準添加法，以信噪比S/N≥10確定定量限（LOQ）為0.5μg/kg，逐級稀釋，以信噪比S/N≥3確定方法檢出限0.25μg/kg，依據(jù)動物源食品克倫特羅限量標準禁止檢出，所以定量限滿足要求。其線性回歸方程見圖1。

圖1 鹽酸克倫特羅標準曲線線性關系

2.5 添加回收率和精密度試驗結果

三種基質(zhì)中，鹽酸克倫特羅的平均回收率80.2%～96.7%，相對偏差（RSD）為0.78～3.1，說明優(yōu)化的前處理方法所得結果的回收率和精密度滿足實驗要求，符合定量分析，其回收率和精密度結果詳見表2。

表2 鹽酸克倫特羅的加標回收率和精密度（n=6）

2.6 方法應用結果

對購買的10份動物源性食品，采用該文建立的方法與（原）農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008方法同時測定其中鹽酸克倫特羅的含量，均為陰性。

3 結論與討論

該研究建立了一種專門用于動物源性食品中鹽酸克侖特羅含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該研究與朱小艾等所建立的方法比較，液質(zhì)比液相定量更為準確；與（原）農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》相比較，對樣品的前處理方法進行優(yōu)化，不需要酶解過程，前處理時間由22h減少為1h，大大縮短前處理時間且提高了加標回收率，回收率高達80.2%～96.7%。

該研究采用乙腈-0.1%甲酸配置質(zhì)量濃度0.5～20 ng/mL的鹽酸克倫特羅標準溶液，按優(yōu)化后的液相質(zhì)譜條件進行測定，線性關系良好，線性方程y=429.858x-53.1756（R2=0.999178），本研究還表明，鹽酸克倫特羅的平均回收率為80.2%～96.7%，相對偏差（RSD）為0.78～3.1，說明優(yōu)化的前處理方法所得結果的回收率和精密度滿足實驗要求，符合定量分析。

通過對市場上采購的10份動物源性食品羊肉、牛肉、豬肉樣品應用該研究所建立的方法進行檢測，檢測結果與（原）農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》一致，表明所采購的樣品均為陰性樣品，不含有鹽酸克倫特羅成分。

各種結果表明，該研究所建立的方法具有快速、簡便、準確的特點，適用于樣品數(shù)量較大時的快速定量檢測，為食品安全監(jiān)管部門提供了一個快速且準確的定量檢測方法。□