煙草非特異性脂質轉移蛋白基因家族的鑒定與分析

李 鵬 劉 徹 宋 皓 姚盼盼 蘇沛霖 魏躍偉 楊永霞,* 李青常

煙草非特異性脂質轉移蛋白基因家族的鑒定與分析

李 鵬1劉 徹1宋 皓1姚盼盼1蘇沛霖1魏躍偉1楊永霞1,*李青常2,*

1河南農業大學煙草學院, 河南鄭州 450002;2中國煙草總公司鄭州煙草研究院, 河南鄭州 450001

植物非特異性脂質轉移蛋白(non-specific lipid transfer proteins, nsLTPs)可以在體外轉移脂質, 調節植物的生長發育以及對環境非生物和生物脅迫作出反應等。本研究從煙草栽培品種K326 (L.)基因組中鑒定出74個nsLTPs基因, 對其系統發育關系、基因結構、保守基序、染色體定位、基因重復、啟動子順式作用元件、3D結構和激素與非生物脅迫處理下的表達模式進行了分析。結果表明, 根據8個半胱氨酸之間的間隔和序列相似性將其分為I、II、III、IV、V、VII、VIII和XIII八種類型, 相同類型的具有相似的內含子-外顯子基因結構和保守基序模式, motif 2和motif 3是NtLTPs基因家族的特征基序。在進化過程中, 片段重復是NtLTPs基因家族擴展的主要原因, 干旱處理后的RNA-seq分析發現, 在進化過程中, 不同基因重復事件發生后功能分化模式存在差異。啟動子分析表明, 它們含有多種光反應、激素和非生物脅迫響應順式作用元件。進一步采用qRT-PCR分析發現, NtLTPs家族基因在煙草植株的不同組織和器官中具有不同的表達模式, 可以響應干旱、鹽等非生物脅迫以及IAA、GA、SA等激素處理。研究結果為深入分析NtLTPs家族基因的功能提供了理論參考, 并為進一步的分子育種提供了理論基礎。

煙草; nsLTPs; 基因家族; 生物信息學; 基因表達

非特異性脂質轉移蛋白(nsLTPs)是一類小的、堿性蛋白質, 分子量約為6.5 kD至10.5 kD, 在高等植物中含量豐富, 占總可溶性蛋白的4%左右[1]。NsLTPs家族的特征是它們都有一個包含8個半胱氨酸的基序(Eight Cysteine Motif, ECM), 其一般形式為C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C (“X”代表任何氨基酸, “n”表示氨基酸殘基數), 三級結構可以形成帶有4個或5個α-螺旋的疏水腔, 在體外可以結合或轉移脂肪酸、脂肪酰基-CoA、磷脂、糖脂和角質單體等疏水分子[2-3]。

NsLTPs是由多個基因組成的復雜家族, 自發現至今, 其分類方法不斷完善。目前nsLTPs的分類主要有3種, 一是根據nsLTPs的分子量大小, 將nsLTPs分為2種類型: nsLTPI (分子量大約為9 kD)和nsLTP II (分子量大約為7 kD)[4]。二是Boutrot等[5]在對水稻、小麥和擬南芥的全基因組分析中, 根據序列相似性以及8個半胱氨酸之間的氨基酸殘基數量將nsLTPs分為9種類型(I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX型)。基于這個分類方法, 而后在其他物種中略有修改, Liu等[6]將135個茄科nsLTPs基因分為5種類型(I、II、IV、IX和X), 額外增加一個X型, I型被劃分為了Ia、Ib、Ic、Id 4個亞型; D’Agostino等[7]將番茄中64個nsLTPs基因分為6個類型(I、II、III、IV、X和XI型), 額外增加了一個XI型。Li等[8]將馬鈴薯中83個nsLTPs基因分為I、II、IV、V、VII、VIII、XII和XIII 8種類型, 增加XII和XIII 2種類型。三是Edstam等[9]在對苔蘚、蕨類等隱花植物的分類時, 根據內含子的位置、編碼蛋白中潛在的糖基磷脂酰肌醇修飾位點和半胱氨酸之間的間隔, 將劃分為10種類型(I、II、C、D、E、F、G、H、J和K)。與此類似的分類方法也被應用于許多物種中, 在對330個小麥、63個玉米和70個大麥nsLTPs基因的分類中, 根據此方法劃分為I、II、C、D、G 5種類型[10-12]。

NsLTPs涉及參與植物許多生理生化過程, 具有多種生物學功能[13], 包括植物的有性生殖、信號傳導、植物角質層蠟質的生物合成、花粉和纖維的伸長、細胞凋亡和果實成熟等過程[14-20]。NsLTPs參與生物與非生物脅迫應激反應。nsLTPs可以作為一種天然的抗菌肽物質, 參與SAR信號轉導過程, 與植物系統獲得性抗性有關, 并在細胞程序性死亡、植物抗逆和抗病過程中起著重要作用[21]。研究發現, 擬南芥參與對干旱脅迫的響應[22]。過表達擬南芥基因可使谷胱甘肽水平升高, 增強抗氧化防御能力, 提高擬南芥對單端孢菌毒素的抗性[23]。水稻中過量表達和基因可提高對真菌和細菌病害的抗性[24]。黃瓜基因在對根結線蟲感染的防御中起重要作用[25]。過表達小麥基因可以提高小麥對禾旋孢腔菌和禾谷鐮孢菌的抵抗能力[26]。除此之外, nsLTPs還是植物性食物和花粉中的過敏原, 引起過敏反應[27-28]。

雖然在一些物種中對nsLTPs基因家族已有相關報道, 但煙草作為一種重要的模式和經濟作物, 還沒有相關報道, 僅對個別基因家族成員的功能進行研究。研究發現, 煙草在葉片表面長柄腺毛中大量表達, 過表達可使葉片脂質分泌增多,顯著提高對蚜蟲的抗性[29]。過表達基因可以調控2個Na+轉運體NHX1和HKT1, 改變煙草體內Na+的穩態, 進而減弱Na+對細胞的毒害作用, 增強煙草對鹽脅迫的耐受性[30]。鑒于此, 本研究擬從煙草中鑒定nsLTPs基因家族, 并對其進行詳細的生物信息學分析, 研究其在不同脅迫下的表達模式, 為進一步深入研究的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 煙草nsLTPs家族成員的搜索和鑒定

從PFAM數據庫中下載nsLTPs蛋白保守的結構域PF00234和PF14368, 并以此為查詢序列, 采用HMMER軟件, 以閾值<1e-5作為默認參數, 在茄科基因組網站(https://solgenomics.net/)進行搜索并下載煙草栽培品種K326基因組序列和其上游2000 bp的啟動子序列, 進一步在PFAM和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)數據庫進行確認, 并使用NCBI保守結構域CDD數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)分析nsLTPs蛋白的保守結構域, 剔除含不完整ECM基序、其他結構域及注釋不完整的序列。

1.2 煙草nsLTPs的序列分析與系統發育樹構建

使用在線工具SignaIP 5.0 (http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/)預測nsLTPs蛋白的信號肽序列; ExPASy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)計算全長蛋白的分子量和等電點。使用MEGA 6.0軟件的Muscle比對全長蛋白, 鄰接法(neighbor- joining, NJ)構建系統發育樹, 參數設置為具有1000次重復的JTT模型。

1.3 煙草nsLTPs的基因結構和motif分析

使用在線網站GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku. edu.cn/)繪制基因的內含子-外顯子結構圖; 在線網站MEME (http://meme-suite.orgGSDS)預測煙草nsLTPs的保守基序, 參數設定保守基序數量為10。

1.4 煙草nsLTPs的染色體定位與共線性分析

在線網站MapGene2 Chrome V2 (http://mg2c. iask.in/mg2c_v2.0/)用來分析可以定位到煙草品種K326染色體上的基因。使用TBtools軟件的Circos功能可視化重復基因對之間的關系。同樣地, 重復基因對之間的Ka/Ks值使用TBtools軟件進行計算[31]。

1.5 煙草nsLTPs蛋白的3D結構分析

使用SWISS-MODEL在線網站預測nsLTPs蛋白的3D結構, 然后用PyMoL軟件進行可視化。

1.6 煙草nsLTPs順式作用元件分析

使用Plantcare (http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/)在線網站預測和分析基因上游2000 bp啟動子的順式作用元件[32]。

1.7 干旱處理下的RNA-seq分析

從NCBI的SRA數據庫中下載六周左右的煙草品種K326幼苗在干旱處理下的RNA-seq數據(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA691642), 并使用TBtools軟件的FastQC和Trimmmonatic功能對測序數據進行質量控制, 去除接頭污染和低質量堿基, 然后將其定位到煙草品種K326的參考基因組上, 最終獲得過濾后的煙草品種K326在干旱處理下基因的表達量用于后續分析。基因表達量的計算使用FKPM法(每百萬fragments中來自某一蛋白編碼基因每千堿基長度的fragments數目), 使用TBtools軟件的Different Gene Expression Analysis (DESeq2)插件作差異基因表達分析, 將FDR (adjusted-value)小于0.05且表達差異大于2的基因視為差異表達基因, 最后使用TBtool軟件的HeatMap功能對基因的FPKM值進行log2標準化后繪制差異基因表達量熱圖。

1.8 植物材料與處理

煙草品種K326采用漂浮育苗, 并在恒定的生長條件(28℃, 16 h光照, 8 h黑暗, 600～800 μmol光子m–2s–1, 相對濕度為60～70%, CO2濃度為400～450 μmol mol–1)下進行培養, 直到生長至4片真葉(生根期)時進行處理, 分別采用100 μmol L-1的脫落酸(abscisic acid, ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、赤霉素(gibberellins, GA)、生長素(auxin, IAA)和2 mmol L-1的水楊酸(salicylic acid, SA)噴灑幼苗, 將幼苗放放置于邊長為40 cm的方形托盤中, 每種激素噴施60 mL。另外, 于37℃下處理幼苗48 h模擬高溫逆境。干旱和鹽脅迫處理是將幼苗分別在濃度為200 mmol L-1甘露醇和200 mmol L-1NaCl的溶液中培養48 h。以上處理, 分別在0、1、3、6、9、12、24和48 h采集從上往下數第2片葉的葉片組織樣本, 每個時刻3個重復。組織表達特異性分析是在開花期收集煙草植株不同組織和器官(根、莖、上部葉、中部葉、下部葉和花), 所有采集的樣品均在液氮中迅速冷凍,-80℃保存, 用于分析基因的表達模式。每個樣品進行3個生物學重復和3個技術重復。

1.9 實時熒光定量PCR

使用植物總RNA分離試劑盒提取每個樣品的總RNA。HiScript II Reverse Transcriptase (NO.R201- 01/02)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行反轉錄。利用Primer 5.0軟件設計實時熒光定量(Quantitative Real-time, qRT) PCR引物, 以作為內參基因(表1)。qRT-PCR反應體系包含1 μL cDNA、5 μL AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, 中國)、正/反向引物各0.5 μL和3 μL ddH2O。在實時熒光定量PCR儀(Eppendorf, 德國)上進行PCR反應, 程序為95℃預變性10 min; 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 35個循環。采用2-ΔΔCT算法計算基因的相對表達量。

表1 引物列表

2 結果與分析

2.1 煙草nsLTPs基因家族成員的鑒定

從煙草品種K326基因組中搜索得到122條序列。使用NCBI的Blastp和CD-Search功能對進行分析, 刪除了47條不包含完整ECM基序、含有其他結構域及注釋不完整的序列和1條富含脯氨酸的序列, 剩余74條序列用于以下分析。

2.2 煙草nsLTPs基因家族成員的序列分析與分類

根據Boutrot等[5]的分類方法, 基于ECM的序列相似性以及8個半胱氨酸之間的間隔, 將煙草品種K326的nsLTPs序列劃分為8種類型: I、II、III、IV、V、VII、VIII、XIII, 沒有VI和IX型, 并依據同為茄科的馬鈴薯中的分類方法, 新增了一個XIII型[23]。對每種類型NtLTPs的8個半胱氨酸之間的間隔進行統計(表2)。I型中的NtLTPs數量最多, 有38條, 其次為IV型, 有10條, III型和V型的數量最少, 各有1條。VII型和VIII的主要區別在于第1個半胱氨酸和第2個半胱氨酸之間的數量, 而XIII型的不同之處在于第6個和第7個半胱氨酸之間的氨基酸殘基數量。

信號肽預測結果顯示, 有67條NtLTPs序列含有N-末端信號肽, 占總序列的90.5%, 信號肽長度約為16～31個氨基酸。通過計算NtLTPs全長蛋白的分子量和等電點發現, 煙草nsLTPs蛋白的分子量相對較小, 大部分為10～15 kD, 而大多數nsLTPs蛋白的等電點在8～10間(圖1)。

表2 煙草nsLTPs八個半胱氨酸基序(ECM)的多樣性

字符“X”代表任何種類的氨基酸, “X”后的阿拉伯數字代表氨基酸殘基的數量。

The character “X” represents any kind of amino acid, and the arabic numeral after the “X” represents the number of amino acid residues.

2.3 煙草nsLTPs的系統發育分析

使用MEGA 6.0軟件, 采用鄰接法構建了煙草nsLTPs的系統發育樹(圖2)。除IV型外, 其余7個類型的煙草nsLTPs分別聚在一起。

2.4 煙草nsLTPs的基因結構和motif分析

通過將煙草的基因組DNA與CDS進行比較, 分析了煙草的內含子-外顯子結構(圖3)。I型的大部分成員含有1～3個外顯子, 其中14條基因沒有內含子, 17條基因含有2個外顯子和1個內含子, 6條基因含有3個外顯子和2個內含子, 而含有5個外顯子和4個內含子。II型中, 有3條基因沒有內含子, 2條基因含有1個內含子, 1條基因含有2個內含子。IV型中, 有3條基因含有4個外顯子, 3條基因含有3個外顯子, 3條基因含有2個外顯子, 1條基因不含內含子。VII型中大多數含有3個外顯子, VIII型大多數含有2個外顯子, 在XIII型中, 有3條基因含有3個外顯子, 3條含有2個外顯子的基因。

每種類型的NtLTPs都由相似的保守基序組成, motif 2和motif 3存在于所有類型的NtLTPs中。另外, 有些保守基序僅存在于少數類型中, 例如, motif 4僅在I型存在, motif 9僅在VIII型存在, motif 7僅在XIII型存在。

同時, 對每種類型的ECM基序進行seqlogo分析(圖4)發現, 每種類型的nsLTPs蛋白都具有保守的ECM基序, 即保守的8個半胱氨酸殘基。

2.5 煙草nsLTPs的染色體定位與基因重復性分析

從煙草基因組中下載了煙草品種K326的染色體長度、基因在染色體上的位置等注釋信息, 74條基因序列中有42條序列定位在染色體上, 以此, 繪制了42條基因在染色體上的分布圖(圖5)。結果發現, 17號染色體上的數量最多, 有7個; 2號和23號染色體上分別有5個。在3、5、6、12、15、18、21和24號染色體上, 分別只有1個基因, 其余6個染色體上不含NtLTPs家族基因。

對42條可以定位到染色體上的序列進行了序列一致性分析, 將序列同一性≥70%視為1個基因對。共找到了7個基因對, 其中有6個基因對屬于I型, 另外1對屬于Ⅳ型。基因重復事件分為串聯重復和片段重復, 基因重復事件導致了物種進化過程中基因家族的擴增[33]。按同一條染色體上的100 kb染色體片段中, 2個基因之間的間隔少于5個基因的標準, 判斷是否為串聯重復基因[34]。結果發現, 7個基因對中有1個串聯重復基因對, 6個片段重復基因對, 對其進行了可視化分析(圖6), 串聯重復發生在17號染色體上。本研究中, 串聯重復和片段重復事件均促進了煙草中nsLTPs家族的擴展, 而片段重復對于擴大煙草nsLTPs基因家族更為重要。

此外, 計算了重復基因對之間的Ka/Ks值以評估煙草的分子進化速率, Ka/Ks的比值可用作選擇壓力的標志(圖7)。Ka/Ks的比值大于1表示正選擇, 小于1表示純化選擇, 等于1則表示中性選擇[35]。結果發現, Ka值在0.01到0.20之間, Ka/Ks值均小于1, 這表明來自煙草品種K326的所有重復基因都是由重復事件后的純化選擇壓力驅動的。

2.6 煙草nsLTPs的3D結構預測

選取8種類型中的9條nsLTPs蛋白序列為代表預測了其蛋白3D結構, 其中, I型NtLTPs的數量較多, 選擇了2條。由圖8可知, 煙草nsLTPs蛋白的3D結構具有nsLTPs蛋白的典型特征, 即4個α-螺旋以及在內部形成的一個疏水空腔。

2.7 煙草nsLTPs的順式作用元件分析

啟動子中的順式作用元件可以作為轉錄因子的結合位點, 并參與基因表達的調控。順式作用元件分布的規律可能揭示了功能和調控水平的差異。使用PlantCARE在線網站預測分析了74個煙草nsLTPs基因的轉錄起始位點2000 bp的上游區域。由圖9可知, 一共篩選了21種順式作用元件。這些元件可以分為3種類型。第1類與植物激素有關, 包括ABRE、AuxRR-core、CGTCA-motif、GARE-motif、P-box、TCA-element、TGACG-motif和TGA-element。第2種類型與非生物脅迫有關, 包括TC-rich repeats、TATC-box、ARE、GC-motif、LTR、MBS、X3.AF1. binding site和MBSI。第3類是光響應有關的元件, 包括ACE、G-box、MRE、Sp1和GT1-motif。不同煙草的啟動子中相關元件的分布規律不同, 表明它們可能執行不同的功能。其中, 與光響應有關的元件如G-box元件、抗氧化反應元件ARE和ABA響應元件ABRE, 在大多數家族基因啟動子中存在, 表明它們可能在調節的功能方面起到重要作用。

2.8 干旱處理下的轉錄組差異基因表達分析

對于從NCBI SRA數據庫獲得的煙草品種K326苗期干旱處理的轉錄組數據, 從中篩選基因家族數據, 使用FPKM算法計算了基因的表達量, 以FDR小于0.05且表達差異大于2為差異標準, 有30個nsLTPs基因在干旱處理后顯現顯著性基因表達差異, log2標準化后繪制差異基因表達量熱圖(圖10), 結果發現, 在干旱處理下, 14個nsLTPs基因表達量顯著性上調, 包含9個I型, 2個II型, IV、VIII和XIII型各1個; 16個nsLTPs基因表達量顯著性下調, 包含4個I型, 7個IV型, 2個VII型、1個VIII型和2個XIII型; 表明不同的nsLTPs家族基因在干旱處理下顯示出不同的表達模式, 雖然表達模式和類型之間沒有特定的對應關系, 但I型和IV型在干旱處理后顯著性上調和下調的基因數目最多。

2.9 煙草nsLTPs基因的表達模式分析

使用qRT-PCR分析了(I型)和(IV型)基因在根、莖、下部葉、中部葉、上部葉和花中的表達模式。由圖11可知, I型基因在煙草品種K326中部葉表達水平最高, 而IV型基因在莖中表達水平最高, 表明基因的表達具有組織特異性, 不同基因組織間的表達模式也存在差異。

使用每個樣本的FPKM數值log2標準化后繪制差異基因表達量熱圖。CK表示未進行干旱處理, D表示干旱處理, 均包含3個重復。紅色和藍色分別表示表達量高和低。

The relative expression levels ofare measured by FPKM value in RNA-seq data and the relative expression heatmap are drew after FPKM normalized by log2. CK represents no drought treatment, and D represents drought treatment. Red and white color indicate high and low expression levels, respectively.

以根中的相對表達量作為對照, 紅色和綠色表示相對表達量高和低。R: 根; ST: 莖; L: 下部葉; ML: 中部葉; UL: 上部葉; F: 花。

The relative expression levels in the roots were used as controls, with high and low relative expression levels in red and green, respectively. R: root; ST: stem; L: lugs; ML: middle leaf; UL: upper leaf; F: flower.

使用qRT-PCR分析了非生物脅迫(干旱、鹽和高溫)和激素脅迫(ABA、SA、MeJA、IAA和GA)處理下(I型)和(IV型)的表達模式(圖12)。結果表明, NtLTPs家族基因可以響應多種激素和非生物脅迫,不同類型的基因在相同的脅迫下表現出相似或不同的表達模式, 例如, 在37℃、NaCl和IAA處理下, 2個基因的表達模式相似; 而在甘露醇(Mannitol)和ABA處理后,基因的表達在6 h或9 h達到高峰, 隨后降低,基因的表達只是略微升高, 隨后下降。

用2–Δ?CT方法計算相對基因表達量。將0 h的相對表達量設置為1。誤差線表示3個生物學重復的標準偏差。37℃: 高溫處理; NaCl: 鹽處理; Mannitol: 甘露醇處理; GA: 赤霉素處理; IAA: 生長素處理; MeJA: 茉莉酸甲酯處理; ABA: 脫落酸處理; SA: 水楊酸處理。*表示在0.05水平上差異顯著。

The relative gene expression was calculated by 2–ΔΔCTmethod. The relative expression of 0 h was set to 1. Error bars represent the standard deviations of three biological replicates. 37°C: high temperature treatment; NaCl: salt treatment; Mannitol: mannitol treatment; GA: gibberellin treatment; IAA: auxin treatment; MeJA: methyl jasmonate treatment; ABA: abscisic acid treatment; SA: salicylic acid treatment. *:< 0.05.

3 討論

NsLTPs在植物界中廣泛存在, 8個Cys通過4個二硫鍵連接形成4個α-螺旋并在內部形成一個疏水腔[36], 是結合和轉移脂質的植物蛋白中功能最重要的一類。本研究鑒定的nsLTPs序列中, 我們刪除了含有不完整的ECM基序的序列。以往的研究中, 由Boutrot等[5]和Edstam等[9]鑒定的nsLTPs序列包含不完整的ECM基序, Wang等[25]在黃瓜中鑒定出的39個nsLTPs都只含有5個Cys, Cys1、Cys2和Cys8缺失, 這與典型的nsLTPs不同。Wei等[11]排除了包含不完整ECM基序的序列, 認為包含不完整的8CM結構不能被認為是nsLTPs。據報道, 保守的8個半胱氨酸基序中2個二硫鍵丟失可能導致水稻在長日和低溫條件下嚴重矮化[37]。目前, 還沒有確定用于劃分nsLTPs的統一標準, 不同的篩選方法可能導致結果的不同, 而且, Cys缺失的序列是否與包含完整8CM結構的nsLTPs序列具有相似的功能, 是否會發生功能的改變, 還需要進一步的研究。

在本研究中, 我們從煙草品種K326基因組中鑒定出74個nsLTPs基因, 基于Boutrot等[5]的分類方法, 我們無法對所有的煙草nsLTPs進行分類。因此, 在Boutrot等分類方法的基礎上, 結合系統發育關系, 基因結構以及保守motif的比較, 最終將其劃分為8種類型(I、II、III、IV、V、VII、VIII和XIII), 沒有VI型和IX型。在Boutrot等的分類方法中, 所有的VI型在Cys7之前的第4位為Val, Cys7之前的第10位為Met, 并以此來和IV型區分, 但是在我們鑒定的煙草nsLTPs中沒有發現滿足上述條件的序列。此外, 在I型中CC和CXC之間氨基酸殘基的數量也有不同, 在本研究的分類中除19之外還有20和22, 這種現象也出現在棉花中(除19之外還含有20)[38]。XIII型為一個新型, 首次在同為茄科的馬鈴薯中出現, 我們的序列中有7條序列符合此分類特征, 在它們第6個和第7個Cys之間有26或30個氨基酸殘基, 以此, 本研究把它們歸為XIII型[8]。

內含子-外顯子結構模式攜帶有基因家族進化的烙印[34]。植物在進化過程中傾向于保留較少內含子或短內含子的基因[40]。本研究中, 大多數基因含有1～3個內含子或沒有內含子, 這與先前的研究結果一致[7,41]。物種在進化過程中, 已知大多數被子植物會經歷整個基因組的一次或多次重復。水稻、小麥和擬南芥的多種nsLTPs亞型的系統進化分析表明, 基因和染色體片段的重復目前仍在繼續。進化中, 重復的基因突變可能導致基因假基因化, 亞功能化(保留祖先基因的某些功能)或新功能化(即該基因獲得全新功能), 從而會出現具有不同生物活性及結構和功能上與nsLTPs已有類型成員明顯不同的蛋白[42]。本研究中, 片段重復對煙草NtLTPs基因家族的擴張更為重要。

干旱處理后的RNA-seq數據分析顯示, 30個nsLTPs基因在干旱處理后顯著上調或者下調表達, 說明nsLTPs家族在干旱調控方面具有重要作用。其中I型和Ⅳ型在干旱處理后顯著性上調和下調的基因數目最多, 分別為9個和4個。對NtLTPs家族的基因重復分析結果也顯示該家族的重復事件主要發生在I型和Ⅳ型間。但不同的重復基因對在干旱處理后呈現不同的表達模式, 比如重復基因對中的(I型)干旱處理后表達量顯著下調, 但(I型)卻檢測不到表達量; 重復基因對(I型)和(I型)以及重復基因對(I型)和(I型)在干旱處理后則分別都呈現下調和上調的完全相反的趨勢; 重復基因對(I型)和(I型)在干旱處理后均上調, 重復基因對(IV型)和(IV型)在干旱處理后均下調, 這表明不同基因在進化過程中重復事件發生后功能分化模式存在差異。

基因的表達受到啟動子中順式作用元件的調控,啟動子區域中順式作用元件的數量和類型對于各種脅迫下的基因表達非常重要。NtLTPs基因家族的啟動子中含有多個響應光照、高溫、低溫、干旱以及激素信號如脫落酸、茉莉酸甲酯、生長素、赤霉素等的順式作用元件, 但不同基因含有的數量及類型存在差異, 說明不同類型的NtLTPs家族基因功能上可能存在分化。采用qRT-PCR分析在非生物脅迫和激素脅迫下的表達模式發現, NtLTPs家族基因可以響應多種激素和非生物脅迫, 不同類型的基因在不同脅迫下具有相似或者不同的表達模式, 暗示了功能上可能存在差異。其中,和基因在干旱處理下的RNA-seq結果都顯著下調, 與甘露醇處理之后2個基因的表達模式基本一致(圖11), 雖然在甘露醇處理之后有短暫的上升, 但隨后呈現出下降的趨勢。總之, 本研究對NtLTPs基因家族的分析對于將來進一步針對特定的基因研究其具體的功能提供了一定的依據。

4 結論

本研究首次從煙草品種K326中鑒定出74個nsLTPs家族基因, 根據8個半胱氨酸之間的間隔和序列相似性將其劃分為8種類型: I、II、III、IV、V、VII、VIII和XIII型, 并對其進行了系統發育分析、內含子/外顯子基因結構、保守motif和染色體定位分析, 相同類型的基因的內含子/外顯子結構、保守motif和3D結構相似。基因重復和進化分析顯示, 片段重復在nsLTPs家族的擴張中更為重要。對干旱處理下的RNA-seq數據進行分析表明, 不同的nsLTPs家族基因在干旱處理下具有不同的表達模式, I型和Ⅳ型基因顯著性上調和下調的基因數目最多, 重復基因對的功能分化模式多樣。基因啟動子含有多種與光響應、激素和非生物脅迫相關的順式作用元件, 采用qRT-PCR驗證了不同激素(ABA、SA、MeJA、IAA和GA)和非生物脅迫(干旱、鹽和高溫)處理下和基因的表達模式, 結果表明, 他們對不同激素和非生物脅迫均有響應, 但在相同的脅迫下表現出相似或不同的表達模式。本研究對NtLTPs家族基因進行了較為全面的系統性分析, 研究結果為深入分析NtLTPs家族基因的功能提供了理論參考。

[1] Carvalho A O, Gomes V M. Role of plant lipid transfer proteins in plant cell physiology-a concise review., 2007, 28: 1144–1153.

[2] Liu F, Zhang X, Lu C, Zeng X, Li Y, Fu D, Wu G. Non-specific lipid transfer proteins in plants: presenting new advances and an integrated functional analysis., 2015, 66: 5663–5681.

[3] Jose-Estanyol M, Gomis-Ruth F X, Puigdomenech P. The eight-cysteine motif, a versatile structure in plant proteins., 2004, 42: 355–365.

[4] Kader J C. Lipid-transfer proteins in plants., 1996, 47: 627–654.

[5] Boutrot F, Chantret N, Gautier M F. Genome-wide analysis of the rice andnon-specific lipid transfer protein (nsLtp) gene families and identification of wheat nsLtp genes by EST data mining., 2008, 9: 86–108.

[6] Liu W, Huang D, Liu K, Hu S, Yu J, Gao G, Song S. Discovery, Identification and comparative analysis of non-specific lipid transfer protein (nsLtp) family in., 2010, 8: 229–237.

[7] D’Agostino N, Buonanno M, Ayoub J, Barone A, Monti S M, Rigano M M. Identification of non-specific lipid transfer protein gene family members inand insights into the features of Sola l 3 protein.(UK), 2019, 9: 1607.

[8] Li G, Hou M, Liu Y, Pei Y, Ye M, Zhou Y, Huang C, Zhao Y, Ma H. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of the non-specific lipid transfer proteins in potato., 2019, 20: 375.

[9] Edstam M M, Viitanen L, Salminen T A, Edqvist J. Evolutionary history of the non-specific lipid transfer proteins., 2011, 4: 947–964.

[10] Fang Z W, He Y Q, Liu Y K, Jiang W Q, Song J H, Wang S P, Ma D F, Yin J L. Bioinformatic identification and analyses of the non-specific lipid transfer proteins in wheat., 2019, 18: 2–17.

[11] Wei K F, Zhong X J. Non-specific lipid transfer proteins in maize., 2014, 14: 281.

[12] Zhang M Y, Kim Y J, Zong J, Lin H, Dievart A, Li H J, Zhang D B, Liang W Q. Genome-wide analysis of the barley non-specific lipid transfer protein gene family., 2019, 7: 65–76.

[13] Chae K, Gonong B J, Kim S C, Kieslich C A, Morikis D, Balasubramanian S, Lord E M. A multifaceted study of stigma/style cysteine-rich adhesin (SCA)-likelipid transfer proteins (LTPs) suggests diversified roles for these LTPs in plant growth and reproduction., 2010, 61: 4277–4290.

[14] Maldonado A M, Doerner P, Dixon R A, Lamb C J, Cameron R K. A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in., 2002, 419: 399–403.

[15] Yeats T H, Rose J K. The biochemistry and biology of extracellular plant lipid-transfer proteins (LTPs)., 2008, 17: 191–198.

[16] Wang H, Sun Y, Chang J, Zheng F, Pei H, Yi Y, Chang C, Dong C H. Regulatory function oflipid transfer protein 1 (LTP1) in ethylene response and signaling., 2016, 91: 471–484.

[17] Zaidi M A, O'Leary S J B, Gagnon C, Chabot D, Wu S, Hubbard K, Tran F, Sprott D, Hassan D, Vucurevich T. A triticale tapetal non-specific lipid transfer protein (nsLTP) is translocated to the pollen cell wall., 2020, 39: 1185–1197.

[18] Deng T, Yao H, Wang J, Wang J, Xue H, Zuo K. GhLTPG1, a cotton GPI-anchored lipid transfer protein, regulates the transport of phosphatidylinositol monophosphates and cotton fiber elongation.(UK), 2016, 6: 26829.

[19] Potocka I, Baldwin T C, Kurczynska E U. Distribution of lipid transfer protein 1 (LTP1) epitopes associated with morphogenic events during somatic embryogenesis of., 2012, 31: 2031–2045.

[20] Finkina E I, Melnikova D N, Bogdanov I V, Ovchinnikova T V. Lipid transfer proteins as components of the plant innate immune system: structure, functions, and applications., 2016, 8: 47–61.

[21] Gebhardt C, Vieths S, Gubesch M, Averbeck M, Simon J C, Treudler R. 10 kDa lipid transfer protein: the main allergenic structure in a German patient with anaphylaxis to blueberry., 2009, 64: 498–499.

[22] Guo L, Yang H, Zhang X, Yang S. Lipid transfer protein 3 as a target of MYB96 mediates freezing and drought stress in., 2013, 64: 1755–1767.

[23] McLaughlin J E, Bin-Umer M A, Widiez T, Finn D, McCormick S, Tumer N E. A lipid transfer protein increases the glutathione content and enhancesresistance to a trichothecene mycotoxin., 2015, 10: e0130204.

[24] Patkar R N, Chattoo B B. Transgenicrice expressing ns-LTP-like protein shows enhanced resistance to both fungal and bacterial pathogens., 2006, 17: 159–171.

[25] Wang X, Li Q, Cheng C, Zhang K, Lou Q, Li J, Chen J. Genome-wide analysis of a putative lipid transfer protein LTP_2 gene family revealsgenes involved in response of cucumber against root-knot nematode ()., 2020, 63: 225–238.

[26] Zhu X, Li Z, Xu H, Zhou M, Du L, Zhang Z. Overexpression of wheat lipid transfer protein gene TaLTP5 increases resistances toandin transgenic wheat., 2012, 12: 481–488.

[27] Gaier S, Marsh J, Oberhuber C, Rigby N M, Shewry P R. Purification and structural stability of the peach allergens Pru p 1 and Pru p 3., 2008, 52: S220–229.

[28] Palacin A, Varela J, Quirce S, Pozo V D, Tordesillas L, Barranco P, Fernandez-Nieto M, Sastre J, Diaz-Perales A, Salcedo G. Recombinant lipid transfer protein Tri a 14: a novel heat and proteolytic resistant tool for the diagnosis of baker's asthma., 2009, 39: 1267–1276.

[29] Choi Y E, Lim S, Kim H J, Han J Y, Lee M H, Yang Y, Kim J A, Kim Y S. Tobacco NtLTP1, a glandular-specific lipid transfer protein, is required for lipid secretion from glandular trichomes., 2012, 70: 480–491.

[30] 徐揚. 非特異性脂轉移蛋白NtLTP4作為正調控因子參與煙草對非生物和生物脅迫的響應. 山東農業大學博士學位論文, 山東泰安, 2018.

Xu Y. Non-specific Lipid Transfer Protein NtLTP4 as a Positive Regulator Involved in Abiotic and Biotic Stress in.PhD Dissertation of Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong, China, 2018 (in Chinese with English abstract).

[31] Chen C, Chen H, Zhang Y, Thomas H R, Frank M H, He Y, Xia R. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data., 2020, 13: 1194–1202.

[32] Lescot M, Déhais P, Thijs G, Marchal K, Moreau Y, Van de Peer Y, Rouzé P, Rombauts S. PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences., 2002, 30: 325–327.

[33] Cannon S B, Mitra A, Baumgarten A, Young N D, May G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in., 2004, 4: 10.

[34] Wang L, Guo K, Li Y, Tu Y, Hu H, Wang B, Cui X, Peng L. Expression profiling and integrative analysis of the CESA/CSL superfamily in rice., 2010, 10: 282.

[35] Yang Z, Bielawski J P. Statistical methods for detecting molecular., 2000, 15: 496–203.

[36] Douliez J P, Michon T, Elmorjani K, Marion D. Mini review: structure, biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolines, the major lipid binding proteins from cereal kernels., 2000, 32: 1–20.

[37] Deng W, Li R, Xu Y, Mao R, Chen S, Chen L, Chen L, Liu Y G, Chen Y. A lipid transfer protein variant with a mutant eight-cysteine motif causes photoperiod-and thermo-sensitive dwarfism in rice., 2020, 71: 1294–1305.

[38] Li F, Fan K, Ma F, Yue E, Bibi N, Wang M, Shen H, Hasan M M, Wang X. Genomic identification and comparative expansion analysis of the non-specific lipid transfer protein gene family in.(UK), 2016, 6: 38948.

[39] Lynch M. Intron evolution as a population-genetic process., 2002, 99: 6118–6123.

[40] Mattick J S, Gagen M J. The evolution of controlled multitasked gene networks: the role of introns and other noncoding RNAs in the development of complex organisms., 2001, 18: 1611–1630.

[41] Li J, Gao G, Xu K, Chen B, Yan G, Li F, Qiao J, Zhang T, Wu X. Genome-wide survey and expression analysis of the putative non-specific lipid transfer proteins inL., 2014, 9: e84556.

[42] Moore R C, Purugganan M D. The evolutionary dynamics of plant duplicate genes., 2005, 8: 122–128.

Identification and analysis of non-specific lipid transfer protein family in tobacco

LI Peng1, LIU Che1, SONG Hao1, YAO Pan-Pan1, SU Pei-Lin1, WEI Yao-Wei1, YANG Yong-Xia1,*, and LI Qing-Chang2,*

1Tobacco College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC, Zhengzhou 450001, Henan, China

Plant non-specific lipid transfer proteins (nsLTPs) can transfer lipids, regulate plant growth and development, and respond to environmental abiotic and biotic stresses. In this study, 74 nsLTPs genes were identified from the genome ofvariety K326, and we analyzed multiple characteristics of these genes, including phylogeny, gene structures, conserved motifs, protein domains, chromosome locations,-elements in the promoter sequences, 3D structure, and the expression patterns under different hormones and abiotic stresses. The results revealed thatin tobacco could be divided into eight types, including type I, II, III, IV, V, VII, VIII, and XIII, according to the interval and sequence similarity between the eight cysteines. The same types ofhad similar intron-exon patterns and conserved motifs, motif 2 and motif 3 were the characteristic motifs offamily. In the process of evolution, fragment duplication dominated the expansion of thefamily. RNA-seq analysis after drought treatment revealed that the functional differentiation patterns of repeat gene pairs were diverse during evolution period. Promoter analysis showed that they contained a variety of cis-acting elements in response to light response, hormones, and abiotic stress. Furthermore, qRT-PCR demonstrated thatfamily genes had different expression patterns in different tissues and organs of tobacco plants, which could respond to abiotic stresses such as drought, salt, and hormone treatments (IAA, GA, and SA etc.). These results provide a theoretical reference for the in-depth analysis of the functions offamily genes and molecular breeding.

tobacco; nsLTPs; gene family; bioinformatics; gene expression

10.3724/SP.J.1006.2021.04240

本研究由河南省科技攻關計劃(農業領域)項目(182102110315,192102110002, 192102110121), 河南省大學生創新創業訓練計劃項目(S202010466013)和河南農業大學本科實驗室開放創新項目(KF1908)資助。

This study was supported by the Henan Province Science and Technology Research Plan (Agricultural Field) Project (182102110315,192102110002, 192102110121), the Henan University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program (S202010466013), and the Open Innovation Project of Undergraduate Laboratory of Henan Agricultural University (KF1908).

楊永霞, E-mail: yyx624@126.com; 李青常, E-mail: ctsrc@126.com

E-mail: lpeng1995@126.com

2020-11-05;

2021-04-26;

2021-05-13.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210513.1258.002.html