水稻ptc1隱性核不育系的創制及其配合力分析

李京琳 李佳林 李新鵬 安保光 曾 翔 吳永忠 黃培勁 龍 湍

水稻隱性核不育系的創制及其配合力分析

李京琳 李佳林 李新鵬 安保光 曾 翔 吳永忠 黃培勁 龍 湍*

海南波蓮水稻基因科技有限公司, 海南?？?570203

細胞質雄性不育系和光溫敏雄性不育系是目前雜交水稻育種、制種中廣泛利用的兩種不育系, 然而這兩種不育系分別具有組配不自由和育性不穩定的缺陷。隱性核雄性不育系可以克服上述缺陷, 創制、鑒定和利用細胞核雄性不育系將成為新一代雜交水稻技術的重要環節。本研究通過篩選9311的輻射誘變突變體庫, 獲得了一個無花粉型隱性核雄性不育突變體。圖位克隆發現的突變位點位于9號染色體上, 是一段包含編碼區在內259.37 kb的大片段缺失。共分離檢測表明, 雄性不育表型是由突變位點造成的。通過分子標記輔助選擇將突變位點回交轉育至兩系不育系C815S和三系保持系五豐B中, 在BC3F3世代分別獲得與輪回親本性狀相似的隱性核不育系C815G和五豐G。配合力分析表明, C815G和五豐G分別具有與C815S和三系不育系五豐A基本相同的配合力水平。本研究為隱性核不育系的創制提供了新的基因和材料資源, 并證實了隱性核不育系代替現有三系和兩系不育系的可行性。

水稻; 雄性不育;; 圖位克隆; 回交轉育; 配合力分析

水稻(L.)是最重要的糧食作物之一, 世界上超過1/2的人口以稻米為主食。據預計, 到2030年水稻產量必須增加40%才能滿足世界人口增長的需求[1]。中國是稻米最大的生產國和消費國, 提高水稻產量是保障我國糧食安全和提高人民生活水平的基石[2]。利用雜種優勢是提高水稻產量的有效方法之一[3], 雜交稻可以將水稻單產提高10%～20%[4]。目前, 我國的雜交水稻種植面積常年保持在1.3×108hm2以上。

我國雜交稻技術研究從1960年代開始, 共經歷了3個階段的發展[5]。第一階段是以胞質不育為核心的“三系法”雜交稻技術。該技術是基于1970年發現的“野敗”型細胞質雄性不育, 它的不育性狀是由線粒體基因突變引起, 可以由核恢復基因()恢復育性[6-7], 因此可以構建一個包含不育系、保持系和恢復系的“三系”系統來實現雜交制種。1973年, 我國在東南亞和國際水稻所引進的品種中篩選出了優良的恢復系古154、泰引1號、IR24、IR665、桂選7號[8], 標志著三系配套的成功[9]。然而由于恢保關系的限制, 細胞質雄性不育的可利用種質資源僅為5%, 親本間遺傳多樣性小, 雜種優勢的潛力無法得到充分利用[5]。第二階段是以光溫敏不育系為核心的“兩系法”雜交稻技術。兩系法是利用其在一定的光溫環境下植株表現出雄性不育, 而在另一光溫環境下轉變為正?？捎奶匦詠矸謩e實現雜交制種和自交繁殖。生產上常用的光溫敏不育系的育性性狀多由、和控制[10]。自1985培育出第一個兩系不育系后, “兩系法”雜交稻目前已占全國雜交水稻播種面積的35%左右, 成為水稻雜種優勢利用的重要途徑[11]?！皟上捣ā陛^“三系法”具有諸多優越性: 其一, 兩系的不育性狀為核基因控制, 不受恢保關系的限制, 因而選育新品種的幾率更大。其二, 不育系可以一系兩用, 減少育種工序和時間成本, 是快速繁育雜交水稻新品種的新途徑。其三, 兩系不育系有豐富的種質資源, 對培育多樣化的雜交稻有極大的促進作用[12]。然而, 環境變化引起的不育系育性轉換將極大增加制種失敗的風險。第三階段將是以隱性核雄性不育系為核心的“遺傳智能化育種技術”[13]。隱性核雄性不育的育性由核基因單獨控制, 不受環境等外部因素的影響, 育性穩定, 可利用的種質資源廣, 因此是雜交育種的理想材料。隱性核不育系無法通過常規方法大量繁殖, 在生產上的應用一直受到限制[14]。直到最近, SPT技術(seed production technology)的出現解決了隱性核不育系的繁殖問題, 使在水稻上大規模利用隱性核不育系進行育種、制種成為可能[15-16]。由于該技術將現代生物技術和傳統雜交育種技術相結合, 這將是育種史上的一次巨大變革, 可能給水稻產量帶來大幅度的提高。

目前在水稻中已有超過20個隱性核不育基因被克隆[17], 其中調控從四分體時期到花粉成熟時期小孢子發育的基因被認為是最理想的隱性核不育基因。這一過程中, 絨氈層細胞起著決定性的作用。水稻中絨氈層的早期發育受Undeveloped Tapetum1 ()基因調控[18], 它是一種loop- helx-loop (bHLH)轉錄因子, 在突變體中, 絨氈層降解延遲, 導致小孢子敗育。最近發現另一個bHLH因子TDR, 它是絨氈層程序性死亡(programmed cell death, PCD)的調控基因, 該基因的突變使絨氈層的PCD啟動延遲, 花粉壁因無法獲得前體物質而形成受阻[19-20]。在擬南芥中,的直系同源基因同樣具有調控絨氈層PCD的功能[21]。Zhang等[22]研究發現TDR還能與EAT1互作, 兩者共同調控PCD的過程。此外, Huang等[23]克隆了一個基因, 它編碼一個679個氨基酸的PHD鋅指蛋白, 是絨氈層PCD的關鍵基因。PTC1 (OsMS1)蛋白還能夠與OsMADS15和TIP2蛋白互作, 并通過調控基因的表達, 進而調控絨氈層的PCD過程[24]。在PTC1的缺失突變體植株中, 絨氈層細胞無限制分裂及增大, 導致絨氈層細胞降解延遲, 烏氏體形成異常, 花粉壁發育缺陷,從而引起完全雄性不育。

除了雄性育性性狀外, 雜種優勢潛力也是評價一個不育系優劣的重要標準。雜種優勢是子一代表現出超越雙親平均值或高于任何一親本的現象[25], 而有研究表明光溫敏不育基因就是一個雜種優勢的QTL位點[26]。利用隱性核不育基因替換光溫敏不育基因或胞質不育基因后, 新不育系是否能保持原不育系的配合力水平, 目前尚無報道。為了調查不育基因對不育系配合力的影響, 本研究首先篩選并鑒定了一個大片段缺失型的新等位突變位點, 然后將該突變位點導入優良的兩系不育系C815S和三系保持系五豐B中獲得了相應的隱性核不育系。對F1表型的分析表明隱性核不育系與相應的兩系或三系不育系具有相似水平的配合力。研究結果顯示了隱性核不育系用于雜交水稻育制種的可行性,的克隆也為隱性核不育系的創制提供了新的基因和材料資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

突變體是通過Co60輻射誘變秈稻9311 (9311)獲得[27]。秈稻品種明恢63和9311用于構建和的F2定位群體。兩系不育系C815S和三系保持系五豐B作為輪回親本, 構建帶有位點的核不育系。R524、R329、R315、R9773、R9103、R730、華占、R6-7、R809、R5431、R51084、R177、?；?380、福豐1658、岳恢9113等15個材料作為父本, 用于配制雜交種。以上材料由海南波蓮水稻基因科技有限公司從相應材料選育單位引進。

1.2 突變體篩選和表型鑒定

2013年11月于海南臨高播種9311突變體庫中的M2家系共計3617份, 在盛花期篩選花藥異常株系, 取其小花在體式顯微鏡下仔細觀察花的各部分結構, 并用碘-碘化鉀溶液(0.6% KI, 0.3% I2)鑒定花粉的育性, 以野生型9311作為對照。對于花粉碘染顯示完全不育的家系, 在田間觀察突變體與野生型的株高、穗長、花期、葉色等農藝性狀并照相記錄, 對突變體材料套袋自交, 并與明恢63雜交, 統計其結實情況。

1.3 遺傳和定位分析

2015年10月在海南臨高用9311和明恢63作父本分別與雜交。2016年2月在臨高種植F1并觀察其表型, 分別混收2個組合F1的自交種。2016年7月在臨高種植2個F2群體, 并統計2個群體中雄性不育株與正常植株的分離情況。使用明恢63/群體的458株F2植株, 根據Michelmore等[28]的BSA (bulked segregation analysis)法進行基因定位。用于檢測分子標記的PCR反應程序為: 94℃變性5 min, 95℃變性20 s, 55℃復性20 s, 72℃延伸30 s, 30個循環, 最后72℃補充延伸5 min。PCR產物經6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳, 1% AgNO3染色10 min, 在0.5%甲醛和2% NaOH混合液中顯影后照相讀帶。

1.4 突變位點的克隆與驗證

根據定位結果, 參考ASM465v1 (http://plants. ensembl.org/Oryza_indica/Info/Index)版本的9311基因組序列, 在連鎖區段開發分子標記精細定位突變位點。參照劉耀光等[29]的側翼序列分離方法分離突變位點序列, 根據突變位點序列設計共分離標記, 并用F2定位群體進行共分離驗證。

用于側翼序列分離的PCR反應分3步進行: 第一步, 使用引物對1664sp1_F和1664AC1_R擴增突變體基因組DNA, 反應程序為: 93℃預熱2 min, 95℃變性1 min; 94℃變性30 s, 60℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 10個循環; 94℃變性30 s, 20℃復性2 min, 72℃延伸3 min; 94℃變性20 s, 58℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 25個循環; 72℃延伸5 min。第二步, 使用引物對1664sp2_F和1664AD1_R擴增第一步產物的40倍稀釋液, 反應程序為: 94℃變性20 s, 65℃復性1 min, 72℃延伸3 min; 94℃變性20 s, 68℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 68℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 50℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 13個循環; 72℃延伸5 min。第三步, 使用引物對1664sp3_F和1664AD2_R擴增第二步產物的10倍稀釋液, 反應程序為: 94℃變性20 s, 68℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 68℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 50℃復性1 min, 72℃延伸3 min, 6～7個循環; 72℃補充延伸5 min。

表1 本研究所用的部分引物

(續表1)

1.5 ptc1-2核不育系的獲得

選用優良的兩系不育系C815S、三系保持系五豐B作為母本, 與的雜合株雜交, 用突變體特異的分子標記(1664F1、1664R1和1664R2)篩選出突變位點雜合型的F1, 種植F1并連續回交3次。每次先用突變體特異標記和的功能標記[30]篩選2位點為雜合型的株系, 再用多態標記篩選回復率高的株系進入下一輪回交。將獲得的BC3F1自交, 用突變體特異標記和的功能標記篩選BC3F2植株, 其中只含有純合突變位點且不含有位點的單株, 即為相應的核不育系, 分別命名為C815G和五豐G。觀察C815G、五豐G、C815S和五豐A的農藝性狀, 并照相記錄, 用碘-碘化鉀分析花粉育性情況。調查植株的株高、抽穗期、穗粒數、穗長、粒長和粒寬, 參照Griffing等[31]的顯著性分析方法, 分析C815G和C815S, 五豐G和五豐A在這6個農藝性狀上的差異。

1.6 雜交種配制

2018年夏在臨高, 以C815G、五豐G、C815S和五豐A為母本, R524、R329、R315、R9773、R9103、R730、華占、R6-7、R809、R5431、R51084、R177、海恢9380、福豐1658和岳恢9113為父本, 根據不完全雙列雜交(North Carolina mating design II, NCII)的方法配制雜交組合。

1.7 配合力分析

2019年春, 將配制的60個雜交組合種植于海南臨高基地(抽穗期間日均溫26～33℃, 日照時長13.1 h)的2個測試點, 按隨機區組試驗設計, 每點重復2次。每個組合種植5行, 每行7株, 單株栽植, 株行距為15 cm × 20 cm。在開始抽穗后, 調查抽穗期; 在黃熟期, 隨機選取中間3株調查總分蘗數、株高、穗長(每株測量5穗)。收取3～5株的種子, 自然干燥后測量粒長、粒寬、穗粒數、結實率、千粒重、單株產量。統計由同一母本配制的雜交組合在各個農藝性狀的平均值, 分析不同母本所配制的雜交組合的表型差異。參考黃遠樟等[32]的方法分析一般配合力和特殊配合力, 用DPS軟件分析2套NCII組合的配合力情況[33]; 根據Griffing等[31]的表型變異方差公式:2P=2G+2E估算父母本對組合間表型變異的貢獻率。

2 結果與分析

2.1 突變體表型

從輻射突變體庫中1664號家系的M2代群體中找到4株雄性不育突變體, 將其命名為。比較與野生型9311的株高、穗長、葉色、抽穗期等農藝性狀, 發現均無顯著差別(圖1-A, B)。解剖小花觀察可見,的花藥明顯變小、變白(圖1-C)。用碘-碘化鉀將花藥染色后在顯微鏡下觀察, 野生型的花粉粒被染成深紫色(圖1-D), 而觀察不到花粉顆粒(圖1-E)。突變體在套袋自交情況下不結實, 而在作為母本與明恢63和9311雜交時能正常結實, 說明突變體是雄性完全不育突變體。2018年冬, 在海南陵水鑒定了突變體的溫敏特性, 結果顯示在低溫下無法恢復育性, 表明該突變體不受光溫環境的影響, 為隱性核不育突變體。

2.2 ptc1-2的定位

突變體與野生型9311、明恢63雜交所獲得的所有F1植株正常可育, 而F2群體中可觀察到育性分離。其中/9311的F2群體中不育株與可育株分別為92株、312株,/明恢63的F2群體中不育株與可育株分別為107株、351株?？ǚ綑z測表明, 2個群體中不育株與正常株的比例都符合1∶3的分離比(表2),突變體表型由核隱性單基因控制。

從400對SSR或InDel標記中篩選到169對在9311和明恢63之間有多態的標記, 從中選取均勻分布于水稻12條染色體上的129對多態標記分別分析/明恢63群體中突變體和正常株的DNA混合池, 獲得位于9號染色體上的2個與不育表型緊密連鎖的標記RM7039、RM257 (圖2-A)。用RM7039和RM257標記分別擴增50個突變單株, 各檢測到8個和5個交換單株(圖2-B), 進一步證實就定位于這一區段內。然而, 使用位于RM7039和RM257之間的標記D9.168擴增這50個單株時, 沒有條帶擴增出來(圖2-B)。

圖1 ptc1-2突變體及野生型9311的表型

A: 灌漿期野生型9311和突變體的植株; B: 蠟熟期野生型9311和突變體的穗; C: 野生型9311和突變體的花器官; D: 野生型9311的花粉碘染; E:突變體植株的花粉碘染。標尺: 15 cm (A); 3 cm (B); 2 mm (C); 150 μm (D)。

A: plants of 9311 andmutant at filling stage; B: panicles of 9311 andmutant at ripening stage; C: floral organs of 9311 andmutant; D: pollen grains of 9311; E: pollen grains ofmutant. Scale bars: 15 cm (A); 3 cm (B); 2 mm (C); 150 μm (D).

圖2 ptc1-2的圖位克隆

A:位點粗定位在9號染色體長臂的RM7039和RM257兩個標記間; B:基因精細定位至D3102和D3676之間, 物理距離為573 bp; C:位點包含從第15,324,556 bp到第15,583,926 bp共259,370 bp缺失, 該缺失片段包含整個基因。

A: thelocus was first mapped to an interval between RM7039 and RM257 on the long arm of chromosome 9; B:was fine mapped to an interval of 573 base pairs between D1380 and D3676; C: thelocus consisted of a 259,370 base-pair deletion from position 15,324,556 base-pair to position 15,583,926 base-pair. The deletion fragment contained the entire coding region of.

表2 ptc1-2突變體的遺傳分析

2.3 突變位點序列克隆及驗證

根據9311基因組序列, 在標記D9.168附近開發了10個新標記, 并用50個突變單株分析這些標記的擴增情況。其中標記D27420、D27560、D461、D3102能擴增出條帶, 而標記D3676、D5146、D27580、D27590、D27650、D27820不能擴增出條帶, 推測可能存在一個大片段缺失。標記D3102和標記D3676之間的物理距離為573 bp (圖2-B)。在標記D3102的上游設計3條熱不對稱PCR特異引物(表1), 隨機引物序列參照劉耀光等[29]設計。使用熱不對稱PCR經過2輪擴增后獲得部分較亮的條帶(圖3-A), 條帶經測序分析后發現突變體在9號染色體第15,324,556位堿基到第15,583,926位堿基處存在259,370 bp的堿基缺失。該缺失片段內包含19個完整的開放閱讀框(open reading frame, ORF), 其中一個ORF為基因(圖2-C)。故將該突變位點命名為。

根據缺失序列, 設計了一組特異的三引物(1664F1, 1664R1, 1664R2)標記(圖2-C)。使用該標記對/明恢63的F2分離群體進行PCR擴增, 結果顯示所有雄性不育表型的F2植株擴增出的產物均為546 bp, 表明發生了259,370 bp片段的純合缺失。而表型正常的F2植株擴增出的產物均為811 bp, 或546 bp和811 bp兩種帶型(圖3-B), 表明不存在259,370 bp片段的缺失或只有一條染色體帶有259,370 bp片段的缺失。這個結果表明259,370 bp片段的缺失與不育表型共分離。

2.4 ptc1-2核不育系的轉育

為了分析隱性核不育基因對雜種優勢的影響, 本研究以為供體, 通過回交轉育的方法將位點導入到C815S和五豐B中, 分別得到的核不育系C815G和五豐G。在C815G和五豐G中,位點被剔除。如圖4所示, C815G與C815S (圖4-A～C), 以及五豐G和五豐A (圖4-F～H)的株高、穗長、葉色、抽穗期、小穗、小花等農藝性狀均無明顯差別。統計分析顯示, C815G和C815S, 五豐G和五豐A在株高、抽穗期、穗粒數、穗長、粒長和粒寬等性狀上均無顯著差異(表3)。值得注意的是C815S (圖4-D)、C815G (圖4-E)和五豐G (圖4-J)均為無花粉型不育系, 五豐A (圖4-I)為花粉敗育型不育系。用182對多態標記檢測C815G和五豐G的遺傳背景, 回復率分別達到了95.4%、96.7%。

圖3 ptc1-2位點側翼序列的分離及共分離分析

A:位點兩側基因組序列分離第2輪TAIL-PCR擴增結果; B:突變體的共分離驗證。雄性不育表型的F2植株擴增出的產物長546 bp, 而表型正常的F2植株擴增出的產物長811 bp或同時有546 bp和811 bp兩條帶。M為D2000 marker。

A: the second round of TAIL-PCR results for isolation of genomic sequences flanking thelocus; B: co-segregation analysis of thelocus with the male sterile phenotype. All PCR products of F2sterile plants were 546 bp in length. The size of PCR products of F2fertile plants was either 811 bp, or 546 bp, and 811 bp. M: DNA 2000 bp marker.

2.5 核不育系的配合力分析

為了分析轉育后不育系的配合力是否發生了改變, 用C815G、C815S、及五豐G和五豐A分別作為母本與15個測試父本, 按照NCII設計進行配組, 獲得2套NCII組合。對這2個NCII群體進行10個農藝性狀的表型考察及配合力分析, 結果顯示, 除株高外, 2對母本配制的雜交組合間表型沒有顯著差異(表4)。但值得注意的是, 個別父本配制的雜交組合結實率有較大提高, 例如, 五豐A/R9773的結實率只有63.5%, 而五豐G/R9773的結實率卻提高到92.9%。

圖4 C815G和五豐G的表型

A: 抽穗期C815S和C815G的植株; B: C815S和C815G的小穗; C: C815S和C815G花器官; D: C815S的花粉碘染; E: C815G的花粉碘染; F: 抽穗期五豐A和五豐G的植株; G: 五豐A和五豐G的小穗; H: 五豐A和五豐G花器官; I: 五豐A的花粉碘染; J: 五豐G的花粉碘染。標尺: 10 cm (A, F); 0.5 cm (B, C, G, H); 200 μm (D, E, I, J)。

A: phenotypes of C815S and C815G plants at heading stage; B: spikelets of C815S and C815G; C: floral organs of C815S and C815G; D: pollen grains of C815S; E: pollen grains of C815G; F: phenotypes of Wufeng A and Wufeng G plants at heading stage; G: spikelets of Wufeng A and Wufeng G; H: floral organs of Wufeng A and Wufeng G; I: pollen grains of Wufeng A; J: pollen grains of Wufeng G. Scale bars: 10 cm (A, F); 0.5 cm (B, C, G, H); 200 μm (D, E, I, J).

表3 C815S、C815G、五豐A和五豐G的農藝性狀分析

方差分析結果如表5和表6。除株高性狀以外, 母本間的差異對雜交組合其他9個性狀的影響并不顯著(>0.05), 說明C815G和五豐G分別與不育系C815S和五豐A基本不存在差異。同時根據NCII的方差分析, 本研究估算了父母本的表型貢獻率, 發現無論是在以C815S和C815G為母本配制的組合中, 還是在以五豐A和五豐G為母本配制的組合中, 株高表型變異的主要提供者是父本, 分別為43.67%和21.32%, 而母本材料對株高表型的變異貢獻僅占4.68%和11.80%。說明盡管母本間的差異顯著影響配組材料間的株高表型, 但其在決定表型變異程度上依然很小。綜上, NCII的方差分析說明, 利用進行育性改良并未明顯改變原有不育系的性狀。

表4 C815G和五豐G配制的雜交組合的表型

*表示差異達到0.05顯著水平; C815S/+、C815G/+、五豐A/+和五豐G/+分別表示C815S、C815G、五豐A、五豐G配制的雜交組合。

*indicates significant differences at the 0.05 probability levels; C815S/+, C815G/+, Wufeng A/+, and Wufeng G/+ indicate the hybrids of C815S, C815G, Wufeng A, and Wufeng G, respectively.

表5 C815S和C815G的田間配合力方差分析

**、*分別表示差異達到0.01和0.05顯著水平。

**and*indicate significant differences at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

表6 五豐A和五豐G的田間配合力方差分析

**和*分別表示差異達到0.01和0.05顯著水平。

**and*indicate significant differences at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

此外, 本研究計算了C815S與C815G, 五豐A與五豐G的一般配合力相對效應值, 如表7所示。C815S與C815G、五豐A與五豐G的一般配合力相對效應值在所有性狀上差異都不大。上述結果表明, 母本的一般配合力相似。

3 討論

利用圖位克隆的方法, 本研究從9311輻射誘變突變體中克隆了一個新的突變位點。該突變位點是一個259.37 kb的大片段缺失, 包括在內的19個ORF均位于該缺失區段內。前人的報道中,編碼一個PHD鋅指蛋白, 參與花粉外壁的形成和絨氈層的發育。突變后造成水稻雄性不育, 但對其他農藝性狀沒有明顯影響[22]。因此推測的雄性不育表型是由缺失造成。除外, 另外18個基因的缺失并未造成明顯突變表型, 表明這些基因可能為水稻的非必需基因。Wang等[34]分析3010份水稻品種重測序數據發現, 有37.9%的基因為非必需基因, 這些基因通常會在不同個體中出現或缺失, 但不影響個體的生長發育。因此,的大片段缺失可能并不影響其在生產上應用。

配合力是衡量一個材料是否具有雜種優勢的重要指標, 它的測定方法包括雙列雜交法、頂交法和多系測交法, 其中不完全雙列雜交法(NCII)是不育系配合力測定的有效方法[35]。為了探究核不育系對雜種優勢的影響, 本研究設計了2組NCII交配試驗, 分別分析了C815G與C815S, 五豐G與五豐A的配合力情況。2組結果均顯示除株高1個性狀外, 其它9個性狀在母本間的差異均不顯著, 表明不育系改良前后配合力水平相似。為了確定雜交組合中株高差異的主要來源, 本研究估算了2組群體中父母本對株高變異的貢獻率, 結果顯示母本材料對株高表型的變異貢獻僅占4.68%和11.80%, 而父本貢獻率達到43.67%和21.32%, 表明組合間的顯著差異主要來源于父本。本研究使用了15個不同來源的恢復系作為測試親本, 其遺傳基礎廣泛, 更能有效降低與被測親本間的互作效應, 從而提高配合力測定水平[36]。

表7 田間一般配合力相對效應值

目前雜交水稻生產中常用的三系和兩系不育系都有缺陷, 如育性不穩定, 可利用種質資源狹小, 制種成本高等。發展新的育種、制種技術成為雜交水稻產業發展的迫切需求[37]。隱性核不育系具有恢復基因廣泛存在, 育性穩定等特點, 可以很好的克服三系和兩系不育系的缺點[14-15]。在本研究中五豐G與五豐A配制的雜交組合的平均結實率雖然沒有顯著差異, 但個別組合如五豐G/R9773的結實率比五豐A/R9773的結實率提高了近30%。一個可能的解釋是使用位點替換三系不育系的核質互作不育系統后, 解除了恢復系和不育系的恢保關系限制, 從而提高了F1代的結實率。但考慮到五豐G的轉育過程, 五豐G遺傳背景中不可避免的會帶有少量9311的遺傳背景, 因此也不能完全排除少量9311遺傳背景的導入對結實率產生了影響。鮑海瀅等[38]利用100個AFLP標記分析3個中國春小麥的BC9近等基因系, 發現它們仍有約0.22%的背景差異, 表明遺傳差異仍然會存在于表型十分相似的植株里。使用更多的三系恢復系與五豐G和五豐A配組進行結實率分析, 將進一步驗證隱性核不育系在大幅增加恢復基因來源和提高種質資源利用率方面的優勢。此外, 五豐G為無花粉型不育, 比碘敗型的五豐A不育更徹底, 同時育性也不受光溫環境的影響, 顯示出隱性核不育系在雜交稻制種安全性方面的優勢。

4 結論

本研究利用圖位克隆的方法從一個秈稻9311輻射誘變突變體中鑒定了一個新的等位突變位點。位點控制雄性不育表型, 不育性狀不受光溫環境影響, 也不影響水稻其他農藝性狀。利用位點創制的隱性核不育系C815G和五豐G保持了相應三系和兩系不育系的配合力, 顯示了核不育系具有與兩系和三系不育系相當的雜種優勢潛力。本研究為核不育系的利用提供了理論依據, 也提供了新的基因和材料資源。

致謝:中國科學院亞熱帶農業生態研究所孫亮副研究員給予本文細致的修改, 謹此致謝。

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Creation and combining ability analysis of recessive genic sterile lines with a newlocus in rice

LI Jing-Lin, LI Jia-Lin, LI Xin-Peng, AN Bao-Guang, ZENG Xiang, WU Yong-Zhong, HUANG Pei-Jing, and LONG Tuan*

Hainan Bolian Rice Gene Technology Co., Ltd., Haikou 570203, Hainan, China

Cytoplasmic male sterile (CMS) lines and photoperiod/thermo-sensitive genic male sterile (PTGMS) lines are widely used as female parents in the commercial production of rice hybrid seeds. however, both systems have their intrinsic defects such as low usage of germplasm resources and unstable sterility. Recessive genic male sterile (GMS) lines, which overcome the pro-blems of CMS and PTGMS lines, have played a key role in the development of next generation technologies for rice hybrid seed production. In this study, a GMS mutantwithout pollen grains was identified from an irradiation-induced mutant library of 9311. Using a map-based cloning approach, a 257.37 kb deletion region was detected, which contained entire coding region ofon chromosome 9. PCR co-segregation analysis showed that the male sterility was completely associated with thedeletion region. Thedeletion locus was then introgressed into a PTGMS line C815S and a CMS maintainer line Wufeng B by marker-assisted backcrossing. Corresponding GMS lines C815G and Wufeng G were obtained at BC3F3generation, which showed the phenotypical similarity to the C815S and Wufeng B lines, respectively. Combining ability tests revealed that C815G and Wufeng G had the same combining ability as C815S and the CMS line Wufeng A in conventional field, respectively. These results indicated thatwas a new allele of, which could be applied for breeding GMS linesand be the potential of GMS lines in rice hybrid seed production.

rice; male sterile;; map-based cloning; backcrossing; combining ability test

10.3724/SP.J.1006.2021.02076

本研究由中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室開放課題項目(20190203)資助。

This study was supported by the Open Project of State Key Laboratory of Rice Biology Foundation of China Rice Research Institute (20190203).

龍湍, E-mail: longtuan2001@aliyun.com, Tel: 0898-66184571

E-mail: 250864463@qq.com

2020-11-15;

2021-03-19;

2021-04-06.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210406.1628.004.html