植物外源多酚氧化酶酶促合成茶黃素的研究進(jìn)展

李 東，李潔媛，雷 雨，童 凱，姜 斌，李亞蘭，唐 璇

四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000

1957年，Roberts E.A.H[1]首次在紅茶中發(fā)現(xiàn)一類由茶多酚類物質(zhì)氧化縮合形成的橙黃色物質(zhì)，并將這類物質(zhì)命名為茶黃素（theaflavins，TFs），這是一類易溶于乙酸乙酯的、含有多個(gè)羥基或酚羥基的苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。至今，研究者們已在自然界中發(fā)現(xiàn)了12種天然的茶黃素組分[2]，其中最主要的組分是茶黃素（theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3'-沒食子酸酯（theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G）和茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯（theaflavin-3, 3-digallate，TFDG）。雖然，茶黃素類物質(zhì)在紅茶中的含量?jī)H在1%左右，但卻是影響紅茶色澤和滋味品質(zhì)的關(guān)鍵性因素[3]。據(jù)現(xiàn)有研究[4]表明，茶黃素可有效降低血糖血脂且抗突變、防癌抗癌，可廣泛應(yīng)用于保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域。

隨著對(duì)茶黃素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不斷認(rèn)識(shí)，研究者們制備茶黃素的方法也從茶湯中直接提取轉(zhuǎn)變成體外模擬氧化系統(tǒng)制備茶黃素[5]。而根據(jù)催化劑的種類，研究者們將體外模擬氧化系統(tǒng)分為化學(xué)氧化系統(tǒng)和酶促氧化系統(tǒng)[6]。其中，化學(xué)氧化系統(tǒng)所利用的催化劑是無機(jī)氧化劑，由于催化劑不具備底物專一性，導(dǎo)致產(chǎn)品純度低，含有較多副產(chǎn)品，且會(huì)對(duì)環(huán)境造成損害，在推廣運(yùn)用中受到一定限制[7]。目前，酶促氧化合成茶黃素所利用的催化劑絕大多數(shù)是來自植物源的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），因其酶底物專一，生成產(chǎn)品純度較高，能較大程度地提高茶黃素濃度，降低生產(chǎn)成本且天然無害，故廣受關(guān)注和運(yùn)用[8]。

1 酶促合成茶黃素PPO的酶源篩選

1983年，Robertson A[9]等人首次在植物體外模擬酶促氧化系統(tǒng)，結(jié)果顯示在半純化的PPO作用下，高純度的兒茶素可在體外制備得到茶黃素。但是，研究中所利用的PPO大多來自茶葉，由于茶鮮葉受季節(jié)局限，且鮮葉中PPO雖然量大，但存在多種同工酶導(dǎo)致成品茶中茶黃素含量并不高[10]。

研究者們近年來積極尋找新的PPO酶源以求代替茶葉PPO催化茶黃素的生成[11]，通過對(duì)比不同來源的PPO酶促合成茶黃素能力（表1），證實(shí)蘋果、梨、山藥、甘薯和桑葉等果蔬中均含有較高活性的PPO且能較好地酶促合成茶黃素，均可作為較合適的酶促合成茶黃素的天然酶源[12-20]。李適[12]和梁燕[13]等人還通過對(duì)比來自不同的植物和微生物中PPO酶促合成茶黃素能力的高低，結(jié)果表明植物PPO酶促合成茶黃素的能力均高于微生物PPO，其原因可能是微生物生成的PPO底物專一性太強(qiáng)，不能高效地將兒茶素催化合成茶黃素，也可能是各試驗(yàn)菌種所需培養(yǎng)條件較為挑剔，培養(yǎng)條件的改變極易導(dǎo)致PPO酶活和酶催化能力的改變，研究表明植物PPO相較于微生物PPO更適合作為酶促合成茶黃素的催化劑。

表1 不同來源的PPO酶促合成茶黃素能力對(duì)比Table 1 Comparison of enzymatic synthesis of theaflavins by PPO from different sources

2 影響酶促合成茶黃素的因素

2.1 酶的種類與濃度

研究表明[21]，在氧氣的作用下，兒茶素可以利用PPO和過氧化物酶（Peroxidase，POD）在植物體外酶促合成茶黃素。其中，PPO僅能將底物兒茶素酶促合成簡(jiǎn)單二聚體和TFs，但POD在此基礎(chǔ)上還會(huì)將簡(jiǎn)單二聚體和TFs繼續(xù)酶促合成復(fù)雜二聚體和茶紅素（Thearubigins，TRs），其反應(yīng)途徑[22]如圖1。江用文等[23]利用PPO和POD對(duì)不同茶樹品種懸浮發(fā)酵產(chǎn)生茶黃素能力進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，PPO活性/POD活性比值越大，其形成茶黃素的能力越強(qiáng)。梁燕[13]通過對(duì)比PPO和POD分別與兒茶素反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)，結(jié)果表明PPO對(duì)兒茶素的親和力要明顯遠(yuǎn)高于POD。夏濤[24]在體外模擬酶促氧化系統(tǒng)中添加不同比例的煮沸青葉，發(fā)現(xiàn)隨著蒸青葉比例的增加，發(fā)酵體系中的酶濃度隨之降低，但煮沸青葉的比例在發(fā)酵后期對(duì)TFs生成含量并無明顯影響，故指出發(fā)酵體系中的酶濃度對(duì)形成茶黃素含量并無太大影響。由于PPO酶濃度對(duì)于酶促生成茶黃素影響的研究報(bào)道較少，酶濃度對(duì)于茶黃素生成的影響仍需更多試驗(yàn)證實(shí)。

圖1 PPO和POD酶促合成茶黃素、茶紅素的反應(yīng)途徑Figure 1 Reaction Pathway of Enzymatic Synthesis of Theaflavin and thearubigins by PPO and POD

2.2 底物種類與濃度

國(guó)外研究者們[25]認(rèn)為在有氧條件下，兒茶素類物質(zhì)兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、EGC和EGCG等可通過PPO酶促合成TFs。Robertson A[26]往體外氧化系統(tǒng)中添加不同濃度和比例的兒茶素類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)體外氧化系統(tǒng)的反應(yīng)底物是酯型兒茶素（EGCG和ECG）的單一或混合體系時(shí)，且其濃度過高就會(huì)抑制PPO活性，最終影響TFs合成量；但反應(yīng)底物是由EC、EGC、EGCG和ECG共同組成混合體系時(shí)，即使處于較高濃度也不會(huì)再抑制PPO活性和TFs合成量。Hilton[27]研究指出，當(dāng)植物鮮葉中有足夠含量的酯型兒茶素（EGCG和ECG）時(shí)，非酯型兒茶素（EGC）含量與TFs形成量呈現(xiàn)高度相關(guān)。由此可見，可通過適當(dāng)增加EC和EGC兒茶素含量，使TFs形成量增加。

2.3 pH值

兒茶素和茶黃素均為不穩(wěn)定物，極易受到環(huán)境光照、pH值以及溫度的影響，可見，pH值是影響茶黃素合成量的關(guān)鍵性因素之一。研究者探究了pH值對(duì)兒茶素反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響[28]：通過改變反應(yīng)系統(tǒng)的pH值發(fā)現(xiàn)，兒茶素類的氧化還原電位隨著pH值的改變而改變，降低沒食子兒茶素的氧化速率，從而影響TFs酶促合成。有研究表明[29]，當(dāng)反應(yīng)體系pH值>6.0時(shí)，可促進(jìn)EC氧化形成茶黃素類物質(zhì)；而當(dāng)pH值<5.0時(shí)，對(duì)形成茶黃素類物質(zhì)有抑制作用。表明體外氧化系統(tǒng)的pH值為5.0～6.0時(shí)，最適合酶促合成TFs。

2.4 溫度

PPO作為蛋白質(zhì)也極易受到溫度的影響，因此反應(yīng)體系溫度必然對(duì)TFs的生成具有一定影響。Robertson A[30]發(fā)現(xiàn)，雖然溫度升高可使酶活相對(duì)提高，但會(huì)增加PPO對(duì)氧氣的需求，情況嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成供氧不足，最終影響TFs的酶促合成。而反應(yīng)體系溫度稍低于室內(nèi)正常溫度，酶促反應(yīng)中PPO活性較高且供養(yǎng)充足，這時(shí)反應(yīng)體系溫度將有利于積累TFs。相關(guān)研究結(jié)果[31]可大致歸納為：雖然溫度是對(duì)TFs生成有較復(fù)雜影響，但總體來說TFs在較溫和的條件下才能生成，其適宜條件大致在15℃～40℃。

2.5 反應(yīng)時(shí)間

植物體外酶促合成TFs主要包括形成過程和降解過程[32]，反應(yīng)時(shí)間將極大程度影響茶黃素生成與積累。研究表明[33]，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TFs含量逐漸增加至最大后開始下降，同反應(yīng)時(shí)間呈二次曲線。但值得注意的是，TF和TF-3'-G的生成速率較快，可在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)生成；而TF-3-G和TFDG的生成速率較慢，可以適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間以獲得更大含量。

3 酶工程技術(shù)在制備茶黃素上的運(yùn)用

3.1 PPO固定化制備茶黃素

研究表明[34]植物外源PPO雖然能較好轉(zhuǎn)化合成茶黃素，但是PPO的穩(wěn)定性和酶活力保持能力較弱。研究者[35]便通過利用固定化酶類的方法以此來提升PPO的熱穩(wěn)定性和使用效率。常用的固定化載體材料主要分為無機(jī)載體、有機(jī)載體、復(fù)合載體和納米載體[36]，其中，無機(jī)載體[37]來源方便、廉價(jià)、無毒，但固定化酶活性較低, 載量小，而有機(jī)載體不易溶于水、含有較多反應(yīng)官能團(tuán)等，但酶活穩(wěn)定性較差, 易分解。而復(fù)合載體[38]是將無機(jī)和有機(jī)載體組合，成為現(xiàn)階段最為常用的固定化材料。納米載體[39]作為新型載體，具有良好的生物相容性，但由于納米載體的設(shè)計(jì)相對(duì)困難且成本較高，現(xiàn)階段仍處于開發(fā)階段。

屠幼英團(tuán)隊(duì)[40]探索了固定化PPO催化茶多酚形成茶黃素的能力，其結(jié)果顯示固定化PPO能實(shí)現(xiàn)兒茶素向茶黃素轉(zhuǎn)化。有研究者[41]利用海藻酸鈉固定化PPO催化兒茶素形成茶黃素，所得茶黃素最高得率可達(dá)到30%以上。Sharma[42]利用活化纖維素固定化PPO，并用其酶促合成TFs，TFs合成效率提升至之前的14倍。不僅如此，Lei[43]也曾利用納米粒子固定化制備PPO，其能將產(chǎn)率提升42.23%。可見，固定化PPO不僅能夠有效地提高酶促合成茶黃素的能力，且能重復(fù)利用制備TFs，有望推廣到生產(chǎn)中。

3.2 PPO工程菌制備茶黃素

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PPO作為體外酶促合成TFs的關(guān)鍵因素，PPO的克隆表達(dá)和工程菌的建立受到研究者們的廣泛關(guān)注，不僅克隆出PPO的基因，而且利用基因表達(dá)技術(shù)制備得到高酶活、高純度的PPO，從而更好地利用其酶促合成TF，極大程度上提高蛋白的表達(dá)效率。

有研究者[44]在大腸桿菌中對(duì)番茄、蘋果和鴨梨的PPO基因編碼區(qū)序列進(jìn)行克隆和表達(dá)，但其表達(dá)產(chǎn)物僅具有較低酶活。其原因其一可能是[45]大腸桿菌存在著自身保護(hù)機(jī)制，把外源蛋白PPO看成外來異物進(jìn)行分解沉淀；其二是由于PPO三維結(jié)構(gòu)存在著兩個(gè)活性中心而具有高酶活性，但大腸桿菌僅作為原核表達(dá)系統(tǒng)，翻譯表達(dá)的蛋白不能折疊形成具有活性的三維結(jié)構(gòu)。

吳貽良[46]用成熟PPO基因構(gòu)建表達(dá)載體，分別把成熟PPO基因分別克隆入非分泌型載體和分泌型載體中，并在畢赤酵母GS115表達(dá)，酶活分別為29.12 U/mg和26.92 U/mg。陳東升[47]將重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株DE3感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白，通過原核誘導(dǎo)表達(dá)而成的PPO活性為50 U/（mL·min），經(jīng)其酶促氧化的茶黃素大多為酯型茶黃素。

4 植物源PPO結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及氧化茶黃素機(jī)理研究

現(xiàn)階段，工業(yè)生產(chǎn)如果想要對(duì)PPO進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以提高合成茶黃素的能力，研究者們就需要進(jìn)一步對(duì)PPO的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及其氧化合成茶黃素的作用機(jī)理進(jìn)行探討。

大多數(shù)植物源的PPO均含有一種相對(duì)分子質(zhì)量約為60 ～ 80 KDa的前體肽，它是由N端延伸區(qū)、催化功能結(jié)構(gòu)域和C端延伸區(qū)共同組成[48]。其中，保守性較低的N端和C端延伸區(qū)是形成酶的基本構(gòu)象和維持其高級(jí)結(jié)構(gòu)的中心，而催化功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一對(duì)銅原子將通過配位鍵結(jié)合CuA區(qū)和CuB區(qū)的His殘基，從而形成一個(gè)具有特定結(jié)構(gòu)的活性部位[49]。

當(dāng)鄰苯二酚作為反應(yīng)底物時(shí)，PPO的多肽鏈會(huì)和反應(yīng)底物的空間構(gòu)象發(fā)生柔性改變，同時(shí)反應(yīng)底物也會(huì)通過作用位點(diǎn)進(jìn)入PPO的活性中心，與PPO多肽鏈上的氨基酸殘基連接，形成不穩(wěn)定的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)極易發(fā)生多肽鏈的扭曲和氫鍵的斷裂，使得PPO催化產(chǎn)物和活性中心分離形成鄰苯醌，鄰苯醌再次發(fā)生次級(jí)氧化作用，形成多結(jié)構(gòu)的氧化聚合產(chǎn)物[50]。

由于植物種類、組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育階段等差異，各植物來源PPO的酶活性和底物特異性存在著較大差異。例如，同為成熟時(shí)期的番茄含有7個(gè)PPO基因、馬鈴薯含有至少6個(gè)PPO基因、蘋果含有至少4個(gè)PPO基因、小麥含有3個(gè)PPO基因編碼等[52]。但是，通過對(duì)不同植物來源的PPO進(jìn)行氨基酸序列分析，結(jié)果表明[53]，茶樹PPO的氨基酸序列同其他植物來源（梨、桃子、胡蘿卜、甘薯、葡萄、蘋果等）PPO的氨基酸序列具有高度同源性（>45%）。

目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫已公布植物的PPO晶體結(jié)構(gòu)，可初步解析晶體結(jié)構(gòu)和特定功能之間的關(guān)系，但由于PPO表達(dá)的復(fù)雜性，其PPO催化茶黃素生成的機(jī)理、途徑以及結(jié)構(gòu)關(guān)系仍然尚不明晰[53]。

周仲華[54]曾利用同源建模的方法將已知基因序列的163個(gè)PPO建立出一個(gè)蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)，并通過將其與反應(yīng)底物（EGCG）進(jìn)行分子對(duì)接，來探究其催化茶黃素生成機(jī)理。結(jié)果證實(shí)，梨、甘薯和蘋果等10種植物源PPO均能夠催化茶黃素生成，而PPO與底物之間的作用取決于活性中心附近的氨基酸，而與一級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有明顯的關(guān)系。

5 展望

目前，有關(guān)外源PPO酶促催化合成茶黃素的研究，主要圍繞的是外源PPO的篩選和合成茶黃素條件的優(yōu)化，可以這些研究為基礎(chǔ)進(jìn)一步建立自動(dòng)化氧化發(fā)酵茶黃素體系。但是，現(xiàn)有植物體外酶促合成TFs體系所用的大多是PPO粗提液，其酶活力尚可但其體系具體成分和酶促氧化機(jī)制尚不明確。因此尋找簡(jiǎn)便高效的PPO分離純化方法，并研究各植物源PPO的酶促氧化能力及酶促氧化機(jī)理將是此后研究的重點(diǎn)。

近年來，酶工程蓬勃發(fā)展，若能在PPO氧化機(jī)理成熟的基礎(chǔ)上，通過基因異源表達(dá)和基因工程菌的構(gòu)建等現(xiàn)代化技術(shù)創(chuàng)造出有較高酶活的、可反復(fù)利用的、高效酶促合成TFs的PPO，既可為茶黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)，又能為指導(dǎo)茶黃素的工業(yè)合成奠定基礎(chǔ)。