連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時(shí)測(cè)定血清中鋅、銅、鐵蛋白結(jié)合態(tài)含量

徐 緯,李 軍,胡 勇,于 春,秦 旭,羅茹丹

(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025)

鋅、銅、鐵等微量元素與人體健康關(guān)系密切[1-6],在過(guò)往研究中,研究者主要探討微量元素總量與疾病的關(guān)系,對(duì)元素形態(tài)檢測(cè)的關(guān)注較少。微量元素在機(jī)體組織中的存在形態(tài)多樣,主要以與生物大分子結(jié)合的形態(tài)和自由離子形態(tài)存在[7],僅檢測(cè)組織中元素總量難以準(zhǔn)確反映微量元素對(duì)疾病的影響機(jī)制,且體內(nèi)微量元素主要以與蛋白結(jié)合的形態(tài)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),故元素蛋白結(jié)合態(tài)檢測(cè)對(duì)疾病預(yù)防、診斷、治療及其機(jī)制研究具有更重要的價(jià)值。

血液和尿液是疾病研究與診治的重要檢測(cè)對(duì)象,其元素分析方法很多[8-13],主要以原子吸收光譜法(AAS)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)應(yīng)用較廣泛,但I(xiàn)CP-AES的高純氬氣消耗量大,檢測(cè)成本較高。AAS目前以連續(xù)光源技術(shù)較為先進(jìn),與銳線光源技術(shù)相比,其背景校正更精準(zhǔn),檢出限更低,在多元素測(cè)定時(shí)無(wú)需更換空心陰極燈[14-16]。

血清中元素形態(tài)分為蛋白結(jié)合態(tài)和非蛋白結(jié)合態(tài),元素與蛋白質(zhì)結(jié)合而存在的形態(tài)稱為元素蛋白結(jié)合態(tài),其他存在形態(tài)皆稱為元素非蛋白結(jié)合態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于血清中元素蛋白結(jié)合態(tài)測(cè)定的相關(guān)研究較少。在已報(bào)道的方法中[17-19],其前處理方法基本相同,測(cè)定元素總形態(tài)時(shí)采用1%(體積分?jǐn)?shù),下同)硝酸溶液直接稀釋血清,測(cè)定非蛋白結(jié)合態(tài)時(shí)采用無(wú)水乙醇沉淀分離蛋白質(zhì),但存在血清樣本消耗量較大、多元素測(cè)定時(shí)操作復(fù)雜、石墨爐法分析速率慢等問(wèn)題。本工作以Sprague Dawley(SD)大鼠血清為方法學(xué)試驗(yàn)對(duì)象,對(duì)上述前處理方法進(jìn)行了改進(jìn),探索建立了連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時(shí)測(cè)定血清中鋅、銅、鐵等元素蛋白結(jié)合態(tài)含量的方法,降低了血清樣本消耗量,可供臨床檢驗(yàn)和疾病基礎(chǔ)研究中血清蛋白結(jié)合態(tài)多元素同時(shí)測(cè)定時(shí)參考使用。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Contr AA700 型連續(xù)光源火焰原子吸收光譜儀;Mettler Toledo AB265-S 型電子天平;Milli-Q型超純水儀;QL-861型漩渦混合器;Z36HK 型高速冷凍離心機(jī)。

鋅、銅、鐵單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L－1。

鋅、銅、鐵混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:5.00 mg·L－1,移取1 000 mg·L－1鋅、銅、鐵單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各0.50 mL,用1%硝酸溶液稀釋,定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為5.00 mg·L－1的鋅、銅、鐵混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

硝酸、無(wú)水乙醇均為優(yōu)級(jí)純;試驗(yàn)用水為超純水(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

SD 大鼠(8周齡,雄性,貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 儀器工作條件

乙炔-空氣(C2H2-Air)火焰;燃燒器高度為6 mm;助燃?xì)饬髁繛?70 L·h－1。鋅、銅、鐵等元素測(cè)定的其他儀器工作參數(shù)見表1。

表1 儀器工作參數(shù)Tab.1 Working parameters of the instrument

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血清中鋅、銅、鐵總形態(tài)含量測(cè)定

取SD 大鼠血清0.5 mL,加入0.25 mL硝酸,靜置10 min,用水稀釋至25 mL,搖勻,按儀器工作條件測(cè)定;以水為空白樣品,同法做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.2 血清中鋅、銅、鐵非蛋白結(jié)合態(tài)含量測(cè)定

取上述相同SD 大鼠血清0.5 mL,加入65%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇溶液6.0 mL,漩渦混勻5 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心5 min,上清液用0.45μm 有機(jī)系濾頭過(guò)濾。取濾液5.0 mL,用2%(體積分?jǐn)?shù))硝酸溶液稀釋至10 mL,搖勻,按儀器工作條件測(cè)定;以水為空白樣品,同法做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.3 血清中鋅、銅、鐵蛋白結(jié)合態(tài)含量的計(jì)算

血清中元素蛋白結(jié)合態(tài)含量等于該元素總形態(tài)含量減去其非蛋白結(jié)合態(tài)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

血液中鐵元素主要分布于紅細(xì)胞中,在樣本采集和血清制備時(shí)要避免發(fā)生溶血現(xiàn)象。

2.1.1 測(cè)定血清中元素總形態(tài)含量和非蛋白結(jié)合態(tài)含量的前處理方法

在測(cè)定血清中元素總形態(tài)含量時(shí),若血清直接用1%硝酸溶液稀釋定容[18-19],則血清溶液在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)呈渾濁狀;而試驗(yàn)選擇先在血清中加入適量硝酸,靜置10 min,使血清中有機(jī)質(zhì)消解,再用水稀釋,使介質(zhì)相當(dāng)于1%硝酸溶液,所得血清溶液澄清。

在測(cè)定血清中元素非蛋白結(jié)合態(tài)含量時(shí),需確保血清中蛋白質(zhì)沉淀完全且蛋白結(jié)合態(tài)元素不脫落、非蛋白結(jié)合態(tài)元素不發(fā)生沉淀反應(yīng),因此血清蛋白質(zhì)沉淀劑的選擇較為關(guān)鍵。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在血清中直接加入蛋白質(zhì)沉淀劑無(wú)水乙醇時(shí)[17-19],沉淀速率較快,未能形成疏松細(xì)小沉淀,另血清具有一定的黏稠度,沉淀將可能包裹少量血清和游離元素。試驗(yàn)選擇在0.5 mL 血清中加入65%乙醇溶液6.0 mL[相當(dāng)于介質(zhì)為60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液],此時(shí)蛋白質(zhì)沉淀率較高[18-19],且血清溶液能在快速混勻過(guò)程中溫和地形成疏松細(xì)小的蛋白質(zhì)沉淀,當(dāng)漩渦混勻時(shí)間大于3 min時(shí),元素非蛋白結(jié)合態(tài)含量趨于平衡,最終確定漩渦混勻時(shí)間為5 min。

2.1.2 分離蛋白質(zhì)沉淀的前處理方法

在分離蛋白質(zhì)沉淀時(shí),不同分離方法對(duì)元素非蛋白結(jié)合態(tài)含量測(cè)定影響較大。濾膜過(guò)濾法能有效分離沉淀,但蛋白質(zhì)沉淀容易堵塞濾膜;離心分離法操作簡(jiǎn)便,但在吸取上清液時(shí)容易吸入少量沉淀而影響測(cè)定結(jié)果。因此,試驗(yàn)采用先離心后過(guò)濾的沉淀分離方法,以保證元素非蛋白結(jié)合態(tài)含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。為避免不同硝酸介質(zhì)濃度對(duì)測(cè)定產(chǎn)生影響,試驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí)均控制介質(zhì)硝酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為1%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取鋅、銅、鐵混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用1%硝酸溶液逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.01,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按儀器工作條件測(cè)定。以各元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:鋅、銅、鐵的質(zhì)量濃度在0.01～0.50 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的吸光度呈線性關(guān)系,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)試驗(yàn)方法分別制備空白溶液,在儀器工作條件下連續(xù)測(cè)定11次,計(jì)算測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)。以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)之比計(jì)算方法的檢出限(3s/k),結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.3 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)對(duì)血清樣本需求量較大,需進(jìn)行多只SD 大鼠血清混勻以制成足夠量的均質(zhì)血清,混勻操作需緩慢,避免產(chǎn)生泡沫。試驗(yàn)采集SD 雄性大鼠血清約15 mL,充分混勻后,按1.3.1 節(jié)和1.3.2節(jié)試驗(yàn)方法分別制備6份供試品溶液,按儀器工作條件測(cè)定,計(jì)算血清中鋅、銅、鐵元素總形態(tài)含量、非蛋白結(jié)合態(tài)含量、蛋白結(jié)合態(tài)含量及測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。其中代表6次測(cè)定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of test for precision(n＝6)

由表3可知,血清中鋅、銅、鐵元素總形態(tài)、非蛋白結(jié)合態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)測(cè)定值的RSD 均小于5.0%,說(shuō)明方法的精密度較好。

2.4 回收試驗(yàn)

取12份SD 大鼠均質(zhì)血清各0.5 mL,均分為4組,分別加入1.00 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.20,0.40,0.60 mL,按1.3.1節(jié)試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理,按儀器工作條件測(cè)定,計(jì)算元素總形態(tài)的加標(biāo)回收率,結(jié)果見表4。

另取12份上述血清各0.5 mL,均分為4組,分別加入65%乙醇溶液6 mL,漩渦混勻5 min,分別加入1.00 mg·L－1混 合標(biāo)準(zhǔn)溶 液0,0.20,0.40,0.60 mL,按1.3.2節(jié)試驗(yàn)方法進(jìn)行后續(xù)處理,按儀器工作條件測(cè)定,計(jì)算元素非蛋白結(jié)合態(tài)的加標(biāo)回收率,結(jié)果見表4。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of test for recovery

結(jié)果表明:在進(jìn)行非蛋白結(jié)合態(tài)加標(biāo)回收試驗(yàn)時(shí),若先在血清中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,鋅和銅的回收率略偏低,這可能是血清蛋白再次結(jié)合了少量加入的元素,因此試驗(yàn)先沉淀血清蛋白后再加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,獲得了較為理想的回收率;元素總形態(tài)和非蛋白結(jié)合態(tài)的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度較高,加標(biāo)回收率為95.3%～104%,進(jìn)而保證了元素蛋白結(jié)合態(tài)含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 樣品分析

取3只同批次健康SD 大鼠,在相同條件下采集血清,每只SD 大鼠血清均按1.3節(jié)試驗(yàn)方法分別制備供試品溶液,按儀器工作條件測(cè)定,每只SD大鼠平行測(cè)定2次,計(jì)算每只SD 大鼠血清中鋅、銅、鐵各元素總形態(tài)、非蛋白結(jié)合態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)含量,結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of samples

結(jié)果表明:大鼠血清中鋅和銅元素主要以蛋白結(jié)合態(tài)存在,在總形態(tài)中占比在60%以上,鐵元素蛋白結(jié)合態(tài)占比相對(duì)較少。

本工作建立了一種連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時(shí)測(cè)定血清中鋅、銅、鐵元素蛋白結(jié)合態(tài)含量的方法。試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,引入干擾較少,具有較好的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度,可為臨床檢驗(yàn)和疾病基礎(chǔ)研究中蛋白結(jié)合態(tài)多元素的同時(shí)測(cè)定提供參考。