反相高效液相色譜法測定保健品中反式維生素K1的含量

羅文芳,張秋華,王 濤

(江西兄弟醫藥有限公司,九江 332700)

維生素K1又稱凝血維生素,化學名為2-甲基-3-(3,7,11,15-四甲基十六-2-烯基)-1,4-萘醌,是肝臟合成凝血酶原的必需物質,具有重要的凝血功能,當體內缺乏時會造成凝血障礙[1-2]。維生素K1常作為一種營養補充劑添加到保健品中,對于維生素K1缺乏癥有很好的預防作用。維生素K1的化學結構式見圖1,其分子側鏈上有一個雙鍵,因而存在順反異構體,天然產物中的維生素K1主要以反式構體存在。大部分藥物分子因其異構特性而具有不同的生物活性,從而產生相應的不良反應。為了減少藥物異構特性帶來的不良反應,對異構體進行拆分是現代藥物研究的重大趨勢[3]。

圖1 維生素K1的化學結構式Fig.1 Chemical structure of vitamin K1

膳食補充劑中通常使用合成的維生素K1,其中可能含有一定的順式結構。維生素K1反式構體具有生物活性,而順式構體不具備[4]。因此,為了能夠更好地評價其營養價值成分,對維生素K1順反異構體的拆分研究顯得尤為重要。目前,藥典中多使用液相色譜正相體系、C30色譜柱[5]、超臨界流體色譜作為分離方法條件對維生素K1順反異構體進行拆分。檢測維生素K1的方法主要有電化學法[6-7]、熒光光譜法[8-10]、高效液相色譜法[11]、色譜-串聯質譜法[12-13]等,這些方法操作復雜且成本高,不利于生產過程中多批次樣品的連續分析。本工作選用常規的流動相和Phenyl柱,能夠較好地分離維生素K1的順反異構體,并對反式維生素K1進行檢測,方法簡單、快速、節約成本。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀,配Chromeleon色譜工作站、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器;ML204T 型分析天平(感量0.000 01 g);KQ-250B型超聲波儀器。

混合標準儲備溶液:稱取8 mg反式維生素K1標準品,2 mg順式維生素K1標準品溶于100 mL棕色容量瓶中,用異丙醇溶解、定容,配制成反式維生素K1質量濃度為80 mg·L－1和順式維生素K1質量濃度為20 mg·L－1的混合標準儲備溶液。

混合標準溶液系列:移取一定量的混合標準儲備溶液,用異丙醇逐級稀釋,配制成反式維生素K1質量濃度為0.04,0.4,0.8,2,4,8 mg·L－1和順式維生素K1質量濃度為0.01,0.1,0.2,0.5,1,2 mg·L－1的混合標準溶液系列。

順、反式維生素K1標準品純度為98%;試驗所用3個品牌的維生素K1補充片劑規格100μg/1 g。

甲醇為色譜純;異丙醇、冰乙酸為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Zorbax SB-Phenyl色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流量0.8 mL·min－1;柱溫25 ℃;紫外檢測波長260 nm;流動相A 為甲醇,B為50 mmol·L－1乙酸溶液。梯度洗脫程序:0～15 min 時,B 為80%;15～35 min時,B 為95%;35～45 min時,B為80%。

1.3 試驗方法

將維生素K1補充片劑研磨成粉后,稱取0.25 g樣品,用異丙醇溶解,并定容至50 mL 棕色容量瓶中,用0.45μm 濾膜過濾,取上清液,將其稀釋成質量濃度為100 mg·L－1的樣品溶液,按照儀器工作條件進樣測定。

2 結果與討論

2.1 溶樣溶劑的選擇

試驗需要在反相體系下測定維生素K1,因此需要選擇一種既能溶于正相又能溶于反相的溶劑,故優選異丙醇。對混合標準溶液進行10次重復測定,計算順、反式維生素K1的保留時間、峰面積、分離度(Rs)以及它們的相對標準偏差(RSD),結果如表1所示。

表1 混合標準溶液的分析結果(n＝10)Tab.1 Analytical results of the mixed standard solution(n＝10)

結果表明:異丙醇對脂溶性維生素K1有較好的溶解性;在反相體系中測定維生素K1時,峰面積和保留時間表現出較好的重現性。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

根據維生素K1的主要特性,目前常用正相體系或反相體系的手性柱、C30色譜柱對其進行拆分。而手性柱和C30色譜柱價格昂貴,不利于大批量樣品的檢測。試驗先考察了Interil ODS-3 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB-AQ 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等普通C18色譜柱對維生素K1的分離效果。結果表明,Interil ODS-3 色譜柱和Zorbax SB-AQ 色譜柱均無法對維生素K1異構體起到拆分的作用,上述色譜柱需借助超臨界流體色譜體系進行拆分。考慮到維生素K1具有較大的苯環結構,試驗選擇Zorbax SB-Phenyl色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)進行試驗,達到了較好的分離效果。

2.2.2 流動相

當以甲醇和水為流動相時,順、反式維生素K1的分離度為0.96,異構體沒有完全分離。通過加入改性試劑乙酸,可提高順、反式維生素K1的分離度。試驗考察了不同乙酸濃度(30,40,50,60,70 mmol·L－1)對順、反式維生素K1分離度的影響,結果如圖2所示。

圖2 乙酸濃度對順、反式維生素K1 分離度的影響Fig.2 Effect of concentration of acetic acid on the resolution of cis-and trans-vitamin K1

由圖2可知:當乙酸濃度為50 mmol·L－1時,順、反式維生素K1分離度最高,因此試驗選擇乙酸濃度為50 mmol·L－1。

2.2.3 梯度洗脫程序

試驗首先通過調節甲醇與50 mmol·L－1乙酸溶液的體積比,等度洗脫維生素K1混合標準溶液。考察了不同體積比(40∶60,50∶50,60∶40,70∶30,80∶20,90∶10)的甲醇-50 mmol·L－1乙酸溶液體系對反式維生素K1洗脫效果的影響,如圖3所示。

圖3 甲醇與50 mmol·L－1乙酸溶液的體積比對反式維生素K1 洗脫效果的影響Fig.3 Effect of volume ratio of methanol to 50 mmol·L－1 acetic acid solution on elution effect of trans-vitamin K1

由圖3可知:當甲醇與50 mmol·L－1乙酸溶液的體積比為80∶20時,反式維生素K1的峰面積最高,洗脫效果較好,因此試驗選擇體積比80∶20作為甲醇-50 mmol·L－1乙酸溶液洗脫的起始比例。

為了將維生素K1異構體快速洗脫,節省分析時間,在梯度洗脫中間過程,增加甲醇與50 mmol·L－1乙酸溶液的體積比至95∶5。

2.3 色譜行為

按照試驗方法測定混合標準溶液和100 mg·L－1樣品溶液,所得色譜圖見圖4。

圖4 混合標準溶液和樣品溶液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of the mixed standard solution and the sample solution

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件,對混合標準溶液系列進行測定,以順、反式維生素K1的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。順、反式維生素K1的線性參數見表2。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結果見表2。

表2 線性參數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行0.03,0.2,1 mg·L－1等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的日內RSD。日間RSD 通過對不同加標水平的樣品連續測定5 d來計算,結果見表3。

由表3 可知:反式維生素K1的回收率為92.0%～95.2%,日 內RSD 為1.6%～2.2%,日 間RSD為2.4%～4.8%;順式維生素K1的回收率為90.0%～101%,日內RSD為1.4%～2.3%,日間RSD為2.6～4.6%。

表3 精密度和回收試驗結果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

2.6 樣品分析

按照試驗方法,對市售的3份維生素K1片劑進行分析。結果顯示:維生素K1片劑A、B、C 中反式維生素K1的檢出量分別為80.12,75.36,78.12μg·g－1。

本工作以Phenyl柱為分離柱,采用反相高效液相色譜法測定保健品中反式維生素K1的含量。該方法操作簡單、經濟,無需使用特殊的C30色譜柱或成本較高的超高效合相色譜(UPC2),可應用于食品成分檢測和常規大量生產過程中維生素K1的分析,為該藥的進一步研究提供了一種有效的分離檢測手段。