超聲提取-凝膠滲透色譜法凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定鴨腸及其制品中6種常見抗生素的殘留量

寧方堯,溫 韜

(1.廣西工業職業技術學院,南寧 530001;2.廣西壯族自治區產品質量檢驗研究院,南寧 530000)

鴨腸是深受廣大老百姓喜愛的動物內臟之一,其不僅味道鮮美、香脆可口,還可以對人體神經系統、視覺系統、消化系統及新陳代謝起到維護作用[1-4]。鴨腸在食用方面可以鹵制、炒制、燙火鍋、燉湯等,市場上有大量預包裝、散裝鴨腸及其制品在售,其中新鮮鴨腸的銷量較大。但鴨子在養殖、培育過程中常會受到病菌、微生物等影響,進而導致患病,如鴨流感等,其以虎斑心為主要癥狀,在局部地區發病率較高,該病癥會導致鴨子呼吸困難、腹瀉,死亡率高。因此,養殖戶常使用抗生素以防治鴨子患病[5-7],常用的抗生素主要有替米考星、羅紅霉素、紅霉素等大環內酯類,氧氟沙星、環丙沙星等喹諾酮類和氟苯尼考等四環素類?？股卦谑褂眠^程中,大部分不能被鴨子充分吸收和代謝,一部分殘留在動物體內,尤其在內臟中殘留量較大;另一部分則通過排泄物、養殖廢水等方式進入到環境中,直接或間接地對人體健康造成危害[8-13]。因此,加強對鴨腸及其制品中抗生素殘留的檢測,對指導規范養鴨、保護人體健康等具有重要的意義。

文獻[14-16]等報道了高效液相色譜-串聯質譜法測定魚肉中4種喹諾酮類藥物的方法,而關于鴨腸及其制品中抗生素殘留的檢測研究報道極少。本工作采用超聲提取法將鴨腸及其制品中替米考星、羅紅霉素、紅霉素、氧氟沙星、環丙沙星、氟苯尼考等常見抗生素提取出來,以凝膠滲透色譜法(GPC)凈化后,采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLCMS/MS)對上述6 種抗生素進行定性分析和定量測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-30 A 型液相色譜-串聯質譜儀,配自動控溫進樣器、四元高壓泵、AB Sciex Triple QuadTM4500型質譜檢測器;KQ-3200型水浴超聲儀;GPC 1000型凝膠凈化色譜;IKA T25型組織勻漿機;QUINTIX 2102-1CN 型電子天平;Beckman Neofuge 18R型冷凍離心機;Milli-Q Direct 16 型超純水儀。

6種抗生素單標準溶液:100.0μg·L－1,移取6種抗生素單標準儲備溶液適量,用甲醇逐級稀釋,配制成質量濃度為100.0μg·L－1的單標準溶液。

混合標準儲備溶液:稱取6種抗生素標準物質各約20 mg,用甲醇溶解并分別定容至100 mL容量瓶中;分別移取0.5 mL 上述溶液于同一個10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配制成6種抗生素質量濃度均為10.00 mg·L－1的混合標準儲備溶液。

混合標準溶液系列:移取一定量的混合標準儲備溶液,用體積比1∶1的甲醇-乙腈混合液逐級稀釋,配制替米考星、羅紅霉素、紅霉素、氧氟沙星、環丙沙星和氟苯尼考質量濃度為0.01,0.05,0.20,0.40,2.00,5.00,10.00 mg·L－1的混合標準溶液系列。

替米考星標準物質(BW 1935-50 mg,質量分數99.0%)、羅紅霉素標準物質(SH-B20801-200 mg,質量分數98.2%)、紅霉素標準物質(SH-B20801-200 mg,質量分數98.6%)、氧氟沙星標準物質(GBW(E)061889,質量分數99.9%)、環丙沙星標準物質(BW 1752-100 mg,質量分數98.4%)、氟苯尼考標準物質(BW 1683-100 mg,質量分數98.1%)。

甲醇、丙酮、乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1)GPC條件Sephadex LH-20色譜柱(250mm×5 mm,10μm);洗脫劑為體積比95∶5的甲醇-乙腈混合液;流量3.5 mL·min－1。

2)超高效液相色譜條件 Waters UPLC BEH C18色 譜 柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱 溫35 ℃;流量0.25 mL·min－1;進樣體積10μL;流動相A 為體積比1∶1的甲醇-乙腈混合液;流動相B為0.2%(體積分數)甲酸溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

3)質譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式;離子噴霧電壓5 500 V;氣簾氣壓力344.8 kPa;輔助氣壓力517.1 k Pa;霧化器壓力379.2 k Pa;離子源溫度560 ℃;多反應監測(MRM)模式。其他質譜參數見表2。

表2 質譜參數Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

將鴨腸或鴨腸制品用組織粉碎機粉碎后,取粉碎后的樣品12.0 g置于50 mL塑料離心管中,依次加入甲醇30 mL、氨水1.0 mL、除水劑無水硫酸鈉3.0 g,均質1 min,超聲(功率200 W,頻率40 Hz)提取15 min,取出冷卻至室溫,以轉速8 000 r·min－1冷凍離心6 min,將上清液全部轉移至GPC 凈化瓶中,按GPC 條件進行樣品凈化。收集1 000～2 400 s的淋洗液,將其置于氮吹儀中,于45 ℃氮吹至近干,殘渣用1 mL甲醇溶解,經0.45μm 濾膜過濾,濾液按儀器工作條件進行測定。

Analysis of the Present Situation and Existing Problems of Dianchi Wetland Park——A Case Study of Wujiadui Wetland Park________________________LI Yuntao 28

2 結果與討論

2.1 凈化方法的選擇

超聲提取鴨腸及其制品中待測目標物抗生素時,基質中與抗生素類似的干擾物質也會被提取出來,如果直接進樣,則會因基線噪聲大導致檢測結果的靈敏度、準確度降低,并對色譜-質譜系統造成損害。常用于抗生素殘留檢測的前處理方法主要有液液萃取法(LLE)、GPC 和固相萃取法(SPE)等。LLE操作簡便,但處理時間長,萃取效率低且凈化效果差,不適用于鴨腸中抗生素殘留的檢測。SPE自動化程度高,但處理步驟冗長,過柱時易造成待測物損失,檢測準確度偏低。GPC 是通過色譜柱進行分離,并截取待測物出峰前后的溶液,凈化效果好,且損失小。試驗分別采用上述不同方法對加標樣品溶液(加標量0.1 mg·L－1)凈化,凈化后的溶液按儀器工作條件進行測定,考察了不同凈化方法對6種抗生素回收率的影響,結果見表3。

表3 凈化方法對6種抗生素回收率的影響Tab.3 Effect of purified method on recovery of 6 antibiotics

由表3可知,與LLE和SPE相比,樣品經GPC凈化后所得各待測物的回收率較高,因此試驗選擇GPC作為凈化方法。

2.2 GPC條件的優化

在GPC系統中,常用的色譜柱主要有以葡聚糖凝膠為固定相的Sephadex LH-20型色譜柱和以聚苯乙烯凝膠為固定相的Bio-beads SX-3型色譜柱。試驗所研究的抗生素均極性較強,易溶于甲醇。Sephadex LH-20型色譜柱是親水親脂型填料,可以使用甲醇、乙腈等強極性溶劑作為洗脫劑,更適用于6種抗生素的洗脫。試驗初始選擇甲醇作為洗脫劑,保持其他GPC條件不變,結果顯示,氧氟沙星和環丙沙星色譜峰拖尾且出峰時間較晚,因此試驗選擇在洗脫劑甲醇中加入強洗脫能力的乙腈,考察了以體積比為97.5∶2.5,95∶5,92.5∶7.5,90∶10的甲醇-乙腈混合液為洗脫劑時6種抗生素的分離效果。結果表明,以體積比95∶5的甲醇-乙腈混合液為洗脫劑時,6 種抗生素峰形較好,且分析時間較短。因此,試驗選擇以Sephadex LH-20 型色譜柱為分離柱,以體積比95∶5的甲醇-乙腈混合液為洗脫劑。

2.3 MRM 模式條件的優化

以替米考星為例,取100μg·L－1替米考星標準溶液,設定質譜掃描模式為全掃描模式(Q1 Scan),找到替米考星母離子;根據找到的替米考星母離子,設定質譜掃描模式為產物離子掃描模式,找到替米考星產物離子,選擇響應較強的2個產物離子,其中1個作為定量離子,另外1 個作為定性離子;最后對替米考星母離子和2個產物離子進行DP和CE優化,建立替米考星的MRM 模式條件。同法建立羅紅霉素、紅霉素、氧氟沙星、環丙沙星和氟苯尼考的MRM 模式條件,優化結果見表2。

2.4 色譜行為

按照儀器工作條件,對0.20 mg·L－1混合標準溶液和加標樣品溶液(加標量為0.20 mg·L－1)進行測定,得到的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液和加標樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standad solution and spiked sample solution

2.5 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件,對替米考星、羅紅霉素、紅霉素、氧氟沙星、環丙沙星和氟苯尼考質量濃度為0.01,0.05,0.20,0.40,2.00,5.00,10.00 mg·L－1的混合標準溶液系列進行測定。以各抗生素的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,6種抗生素的線性范圍均為0.01～10.00 mg·L－1,線性回歸方程和相關系數見表4。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結果見表4。

表4 線性參數及檢出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度和回收試驗

對樣品進行0.01,0.20,4.00 mg·L－1等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平配制6份,按試驗方法進行測定,并計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表5。

表5 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 重復性試驗

按照試驗方法處理樣品,制備含6種抗生素質量濃度為0.10 mg·L－1的加標樣品溶液,平行配制6份。按照儀器工作條件,對上述樣品溶液進行重復性試驗,并計算測定值的RSD。結果顯示,替米考星、羅紅霉素、紅霉素、氧氟沙星、環丙沙星和氟苯尼考測定值的RSD依次為3.7%,2.3%,2.9%,3.2%,4.0%,4.3%,表明此方法具有良好的重復性。

2.8 樣品分析

按照試驗方法分別對市售的鴨腸及其制品中6種抗生素的含量進行測定,結果見表6。

表6 樣品分析結果Tab.6 Analytical results of the samples

結果顯示:在鮮鴨腸中檢出替米考星和氟苯尼考,在鴨腸串中檢出氧氟沙星和氟苯尼考,而在鹵制鴨腸中未檢出目標抗生素。

本工作采用超聲提取和GPC 凈化技術,結合UHPLC-MS/MS建立了測定鴨腸及其制品中6種抗生素殘留量的分析方法。該方法具有檢出限低、精密度和重復性好等優點,適用于鴨腸及其制品中殘留抗生素的測定,可為完善國家監管技術提供參考。