超高效液相色譜-三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法鑒定地錦草化學(xué)成分及超高效液相色譜法建立地錦草指紋圖譜

馮光維,黃春麗,許義紅,龔 元,魏學(xué)軍,韓忠耀

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,都勻 558000)

地錦草為大戟科植物斑地錦或地錦的干燥全草[1-2]。?中國植物志?中記載地錦草的來源包含土庫曼大戟、小葉地錦、新竹地錦、地錦、斑地錦、小葉大戟、匍匐大戟、匍根大戟、臺(tái)西地錦、千根草等。地錦草的廣泛來源,加大了該藥材質(zhì)量控制的難度,也體現(xiàn)了該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究的重要性。據(jù)報(bào)道,地錦草中的化學(xué)成分種類豐富[3-5],富含沒食子酸、槲皮素[6-8]、黃酮類化合物[9]等,因此以一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)性化學(xué)成分對(duì)地錦草進(jìn)行藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)不全面,不能客觀地反映藥材的整體質(zhì)量。

超高效液相色譜-三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥、民族藥化學(xué)成分的快速分析,同時(shí)指紋圖譜技術(shù)能夠更加全面地反映藥材的內(nèi)在整體化學(xué)成分類型,并且可應(yīng)用于中藥、民族藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)[10-12]。目前,有關(guān)地錦草指紋圖譜的相關(guān)報(bào)道多采用高效液相色譜法(HPLC)建立指紋圖譜[13-15]。而超高效液相色譜法(UHPLC)在HPLC 基礎(chǔ)上以分離度高、分析時(shí)間短、高效等特點(diǎn)更具有推廣應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)[16-17]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),有關(guān)不同產(chǎn)地的地錦草的UHPLC指紋圖譜以及采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)快速分析其化學(xué)成分的研究尚未見報(bào)道。

本工作以不同產(chǎn)地的12批地錦草為研究對(duì)象,采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)指征其化學(xué)成分,建立了不同產(chǎn)地的12批地錦草的UHPLC指紋圖譜,提高了分析效率,為地錦草質(zhì)量控制研究及臨床用藥提供了參考與試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC 型超高效液相色譜儀;LC-30AD 型超高效液相色譜-Triple TOF 4600 型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀;Sorvall ST16R 型離心機(jī);Milli-Q 型超純水機(jī);KQ-300B 型超聲清洗儀;FW177型高速粉碎機(jī);Mettler Toledo XP205型電子天平;FA124型電子天平。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取適量的沒食子酸、槲皮素、木犀草素、芹菜素、山奈酚、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品,加入適量甲醇,超聲(頻率40 k Hz,功率300 W)處理2 min,溶解后,用甲醇定容至25 mL 容量瓶中,配制成含291.20 mg·L－1沒食子酸、208.40 mg·L－1槲皮素、88.00 mg·L－1木犀草素、86.80 mg·L－1芹菜素、89.20 mg·L－1山奈酚、308.00 mg·L－1鞣花酸的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1mL,置于10mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成含29.12mg·L－1沒食子酸、20.84mg·L－1槲皮素、8.80mg·L－1木犀草素、8.68mg·L－1芹菜素、8.92mg·L－1山奈酚、30.80mg·L－1鞣花酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,避光保存。

沒食子酸、槲皮素、鞣花酸、山奈酚、芹菜素、木屑草素標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于98%;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

12批(S1～S12)地錦草樣本購自不同產(chǎn)地,經(jīng)鑒定為大戟科植物地錦的干燥全草。其中,S1～S3批次產(chǎn)地為貴州省松桃縣;S4～S6批次產(chǎn)地為河南省安陽縣;S7～S9批次產(chǎn)地為安徽省亳州市;S10～S12批次產(chǎn)地為廣西興安縣。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 UHPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)條件

1)色譜條件 參照文獻(xiàn)[18-20]分析條件并進(jìn)行優(yōu)化。Acquity HPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);二極管陣列檢測(cè)器(DAD),檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;流量0.3 mL·min－1;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量2μL;流動(dòng)相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.50 min時(shí),B 為10%;0.50～7.00 min 時(shí),B 由10%升至85%,保持4.00 min;11.00～11.50 min時(shí),B由85%降至10%,保持3.50 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正、負(fù)離子(ESI＋,ESI－)模式;質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比(m/z)50～1 000;干燥氣壓力379 k Pa,輔助氣壓力379 k Pa,氣簾氣壓力172 k Pa;霧化溫度600 ℃;采用飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子關(guān)聯(lián)采集(TOF-MSProduct Ion-IDA)掃描模式,TOF-MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描Product Ion-IDA 離子累積時(shí)間分別為250,100 ms;采用多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)作為二級(jí)觸發(fā)條件,解簇電壓80 V,碰撞能量為45 eV 或－30 eV,碰撞能量疊加為±15 e V。

1.2.2 UHPLC指紋圖譜條件

同1.2.1節(jié)色譜條件,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.3 試驗(yàn)方法

將地錦草用粉碎機(jī)打碎后,過三號(hào)篩(50目,孔徑0.300 mm),稱取約2.0 g樣品于具塞錐形瓶中,加入50 mL 80%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液,密塞,稱重,超聲(頻率40 k Hz,功率300 W)處理45 min后,放冷,稱重,用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用定性濾紙過濾。濾液以轉(zhuǎn)速12 000 r·min－1離心10 min,經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾,制得供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPLC-Q-TOF-MS定性方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S2樣品1份,按試驗(yàn)方法和儀器工作條件進(jìn)樣檢測(cè),連續(xù)進(jìn)樣6次,以鞣花酸峰為參比峰,記錄16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間,并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,RSD 為0.58%～2.0%,說明儀器的精密度良好。

取同一批次S2樣品,共6份,按試驗(yàn)方法和儀器工作條件檢測(cè),以鞣花酸峰為參比峰,記錄16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間,并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間的RSD。結(jié)果表明,RSD 為1.3%～1.9%,說明該方法重復(fù)性良好。

取S2樣品1份,按試驗(yàn)方法和儀器工作條件,于0,2,4,8,12,24 h分別進(jìn)樣檢測(cè),以鞣花酸峰為參比峰,記錄16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間,并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間的RSD。結(jié)果表明,RSD 為1.4%～2.4%,說明方法在24 h內(nèi)可穩(wěn)定定性。

2.2 地錦草化學(xué)成分的鑒定

中藥材化學(xué)成分復(fù)雜,同時(shí)由于存在不同種屬,造成了其在臨床應(yīng)用中藥物開發(fā)與質(zhì)量控制中的困難。多功能串聯(lián)的高分辨率質(zhì)譜(HR-MS)為化合物的快速檢測(cè)和復(fù)雜結(jié)構(gòu)的識(shí)別提供了工具[21-22]。

由文獻(xiàn)[23-25]可知,地錦草化學(xué)成分類型基本相似。取地錦草S2 樣品,按照試驗(yàn)方法制備供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行檢測(cè),得到地錦草的總離子流色譜圖見圖1,各化學(xué)成分鑒定結(jié)果見表2。

表2 地錦草中化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of chemical constituents in Euphorbia humifusae Willd.

表2 (續(xù))

圖1 地錦草的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of Euphorbia humifusae Willd.

2.3 UHPLC指紋圖譜條件的優(yōu)化

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

以DAD 為檢測(cè)器,地錦草中沒食子酸在270 nm 處有特征紫外吸收,而鞣花酸、槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素等成分在254,360 nm 處有紫外吸收。因此,考察了在203,210,230,254,270,345,360 nm 處地錦草的色譜圖。結(jié)果表明,在檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm 處被檢出的色譜峰較多,分離相對(duì)較好且基線平穩(wěn),因此試驗(yàn)選擇254 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 參照峰

移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液各2μL,注入U(xiǎn)HPLC進(jìn)行分析檢測(cè),記錄色譜圖,見圖2。

由圖2可知,鞣花酸峰的保留時(shí)間適中,分離度高且峰面積較大。在不同批次的地錦草樣品的UHPLC色譜圖中得到相同結(jié)果。因此,試驗(yàn)選擇鞣花酸峰作為參照峰。

2.4 地錦草UHPLC 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取不同產(chǎn)地的12批地錦草樣品,按照試驗(yàn)方法進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖。將不同產(chǎn)地的12批地錦草的UHPLC譜圖以AIA 格式分別依次導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)?中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)?軟件(2004 A 版)中,以S1批次樣本色譜圖作為參照譜進(jìn)行指紋匹配,以中位數(shù)生成對(duì)照?qǐng)D譜(R),經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配,建立了地錦草UHPLC 指紋圖譜共有模式,見圖3。

由圖3可知,通過UHPLC技術(shù),建立了不同產(chǎn)地的12批地錦草UHPLC 指紋圖譜,獲得了16個(gè)共有峰[同圖2(b)],通過對(duì)照品(混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)比對(duì)指認(rèn)其中6 個(gè)共有峰,分別為峰1(沒食子酸)、峰4(鞣花酸)、峰13(槲皮素)、峰14(木犀草素)、峰15(芹菜素)、峰16(山奈酚)。并且,峰1、峰2、峰4、峰7、峰9的峰面積較大,峰13、峰14、峰15、峰16的峰面積較小,其他峰的峰形和相對(duì)峰面積比較穩(wěn)定,體現(xiàn)了地錦草的共同特征。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of mixed standard solution and sample solution

圖3 不同產(chǎn)地的12批地錦草指紋圖譜共有模式Fig.3 Common pattern of fingerprints of 12 batches of Euphorbia humifusae Willd.from different habitats

計(jì)算對(duì)照指紋圖譜與不同產(chǎn)地的12批地錦草指紋圖譜的相似度,結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地的12批地錦草UHPLC指紋圖譜的相似度結(jié)果Tab.3 Similarity results of UHPLC fingerprints of 12 batches of Euphorbia humifusae Willd.from different habitats

由表3 可知:12 批地錦草相似度結(jié)果為0.841～0.985。其中,產(chǎn)地為廣西興安縣的3 批地錦草在本試驗(yàn)條件下的相似度為0.841～0.898,其余均大于0.900,存在較小差異,這可能與地域環(huán)境、土壤環(huán)境和氣候差異有關(guān),表明地錦草在同一地域中的品質(zhì)差異較小,質(zhì)量穩(wěn)定。

基于UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù),從地錦草中共鑒定出37種化合物,包括眾多具有中藥活性的物質(zhì)如有機(jī)酸和黃酮類化合物等,其中棕櫚酸、γ-氨基丁酸、肉桂酸等多個(gè)化合物為地錦草中首次發(fā)現(xiàn),其在臨床應(yīng)用中具有抗炎及免疫活性等藥效。

本工作采用UHPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)快速鑒定地錦草中37種化學(xué)成分,同時(shí)將UHPLC方法應(yīng)用于地錦草的指紋圖譜研究中,對(duì)地錦草質(zhì)量評(píng)價(jià)進(jìn)行研究。該方法準(zhǔn)確、可靠,可用于地錦草化學(xué)成分的快速鑒別和藥材的質(zhì)量控制。