化學發光分析與高效液相色譜聯用測定蘆丁片劑中蘆丁含量

吳 華,閔媛婷,劉立明,石小濤,鄭 軒,胡飛躍,夏志剛,雷克亮,胡雙修?

(1.三峽大學 第二人民醫院,宜昌 443000;2.三峽大學 生物與制藥學院,宜昌 443002;3.三峽大學 水利與環境學院,宜昌 443002;4.湖北省黃岡市生態環境局麻城市分局,麻城 438300)

蘆丁又稱蕓香苷,化學名為5,7,3,4-四羥基-3-蕓香糖黃酮,廣泛存在于中草藥中,其在豆科植物槐米、蕓香科植物蕓香草、蓼科植物蕎麥、鼠李科植物光枝勾兒茶及大薊科植物野梧桐中的含量特別高。

蘆丁的顯著特點是具有很強的抗氧化性和清除自由基的能力,因而具有抗衰老、抗基因突變、抗癌等功效。蘆丁還具有鎮咳、利尿、鎮痛、抗炎、抗病毒和增強免疫力等功能,對預防和治療心腦血管疾病、痛風和糖尿病等均有顯著療效[1-3]。因此,蘆丁在臨床上用途十分廣泛,具有巨大的藥用價值。

蘆丁含量的測定對其藥劑質量控制具有十分重要的意義。檢測蘆丁的常用方法有電極法[4]、熒光分光光度法[5]、高效液相色譜法等[6]。電極法檢測儀器便宜,但選擇性差、靈敏度低;熒光光譜法和高效液相色譜法的選擇性較好、靈敏度較高。流動注射化學發光分析檢測蘆丁的方法有鐵氰化鉀直接氧化蘆丁化學發光法[7]、蘆丁增強魯米諾-高錳酸鉀化學發光法[8]。化學發光分析具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡單、易操作、分析快速等優點,但選擇性較差[9-12]。本工作將化學發光分析與高效液相色譜聯用來檢測蘆丁,較好地彌補了化學發光分析選擇性差的缺點。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-6A 型高效液相色譜儀;BPCL 型微弱發光測量儀;HL-2型恒流泵;RF-540 型熒光儀;751 型分光光度計;HY-B1型超聲波振蕩器。

魯米諾標準儲備溶液:稱取0.886 0 g魯米諾于500 mL燒杯中,加入1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液20 mL,用水溶解并轉移至500 mL容量瓶中,定容,搖勻,配制成濃度為1.0×10－2mol·L－1的魯米諾標準儲備溶液,于4 ℃保存,儲存15 d以上再用于試驗(儲存15 d以上,其化學發光效果好,靈敏度高,而新配制的魯米諾溶液,化學發光效果差,靈敏度低)。

蘆丁標準儲備溶液:稱取0.040 0 g 蘆丁于100 mL燒杯中,用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中,配制成質量濃度為0.40 g·L－1的蘆丁標準儲備溶液,于4 ℃保存。

高錳酸鉀標準儲備溶液:稱取1.580 3 g高錳酸鉀于100 mL燒杯中,用水溶解并轉移至100 mL棕色容量瓶中,定容,搖勻,配制成濃度為1.0×10－1mol·L－1的高錳酸鉀標準儲備溶液,于4 ℃保存。

蘆丁片劑1～3,規格25 mg/片,每片0.5 g(換算標示量50.00 mg·g－1);所用試劑均為分析純;試驗用水為去離子二次蒸餾無酚水(在蒸餾器里加少量高錳酸鉀,使酚類物質被高錳酸鉀氧化后揮發,棄去開始0.5 h內接收的蒸餾水,隨后接收的蒸餾水將不含酚類)。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫40 ℃;流量1.0 mL·min－1;流動相為體積比6∶4的甲醇-2%(體積分數,下同)冰乙酸溶液的混合液(即體積比60∶40∶1的甲醇-水-冰乙酸混合液);進樣體積20μL。

2)化學發光條件 氫氧化鈉-魯米諾混合溶液(其中氫氧化鈉濃度為2.0×10－2mol·L－1,魯米諾濃度為2.0×10－5mol·L－1);1.5×10－4mol·L－1的高錳酸鉀溶液;流量4 cm·s－1;檢測盤管長度為10 cm。

1.3 試驗方法

1.3.1 化學發光分析與高效液相色譜的聯用原理

改裝BPCL 型微弱發光測量儀,將流通池盤管正對檢測窗,流動注射進樣。按圖1連接高效液相色譜儀和化學發光分析檢測系統。

圖1 化學發光分析與高效液相色譜聯用流程圖Fig.1 Flow diagram of high performance liquid chromatography coupled with chemiluminescence detection

將氫氧化鈉溶液和魯米諾溶液先經三通與高效液相色譜儀出口端混合,流經混合管(MC,5 cm),再經三通與1.5×10－4mol·L－1高錳酸鉀溶液混合,進入流通池盤管(10 cm)。在強堿性條件下,高錳酸鉀氧化魯米諾發生化學發光反應,經高效液相色譜儀洗脫分離的蘆丁對該化學發光反應產生增敏作用。BPCL型微弱發光測量儀將檢測到的流通池盤管中的化學發光強度信號轉化為數字信號,并輸入聯用的計算機中,計算機每0.1 s自動采集一個數據,以峰高定量。根據蘆丁的質量濃度與化學發光強度信號的峰高建立線性回歸方程。

流動相、蘆丁標準溶液、蘆丁樣品溶液需經0.45μm 濾膜過濾、超聲波振蕩器振蕩去氣泡,靜置30 min后使用。

1.3.2 樣品的測定

將市售蘆丁片劑在干燥器中干燥8 h后,于研缽中研磨成粉末,稱取1.00 g蘆丁粉末于索氏提取器中,加入100 mL甲醇后,回流加熱5 h,提取液經0.45μm 濾膜抽濾,超聲波振蕩器振蕩去氣泡,靜置30 min,制得待測樣品溶液。用20μL進樣器進樣,按上述儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

在流量為1.0 mL·min－1、流動相為體積比6∶4的甲醇-2%冰乙酸溶液的混合液的條件下,蘆丁標準溶液和蘆丁樣品溶液的色譜圖見圖2。

由圖2可知,蘆丁的保留時間為6.20 min,在上述色譜條件下,蘆丁具有較好的分離效果。

圖2 蘆丁標準溶液和蘆丁樣品溶液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of rutin standard solution and rutin sample solution

2.2 化學發光反應條件的選擇

2.2.1 氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度

由于高錳酸鉀氧化魯米諾產生化學發光反應需要在pH 大于12的強堿性介質中進行,而甲醇-冰乙酸流動相體系為酸性,因此可通過增大氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度,使流通池盤管中混合液pH 大于12。

試驗緩慢增大氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度,并同步檢測流通池盤管中混合液的酸度。結果表明,當氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度增大至2.0×10－2mol·L－1時,流通池盤管中混合液的pH 剛好達到12,因此試驗選擇氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度為2.0×10－2mol·L－1。

2.2.2 魯米諾的濃度

試驗考察了魯米諾的濃度對化學發光強度的影響,結果見圖3。

圖3 魯米諾濃度對化學發光強度的影響Fig.3 Effect of concentration of luminol on intensity of chemiluminescence

由圖3可知:當魯米諾的濃度較低時,化學發光強度隨魯米諾濃度的增大而增大;當魯米諾的濃度超過2.0×10－5mol·L－1時,化學發光強度隨魯米諾濃度的增大而降低,這可能是因為魯米諾對化學發光反應產生的光子有吸收作用[12],從而導致化學發光強度降低。因此,試驗選擇魯米諾濃度為2.0×10－5mol·L－1。

2.2.3 高錳酸鉀的濃度

試驗考察了高錳酸鉀的濃度對化學發光強度的影響,結果見圖4。

圖4 高錳酸鉀濃度對化學發光強度的影響Fig.4 Effect of KMn O4 concentration on intensity of chemiluminescence

由圖4可知:當高錳酸鉀的濃度較低時,化學發光強度隨高錳酸鉀濃度的增加而增大;當高錳酸鉀的濃度超過1.5×10－4mol·L－1時,化學發光強度隨著高錳酸鉀濃度的增大而降低,這可能是因為高錳酸鉀的分解產物二氧化錳沉淀物對化學發光反應產生的光子有散射作用,導致化學發光強度降低。因此,試驗選擇高錳酸鉀的濃度為1.5×10－4mol·L－1。

2.2.4 檢測盤管與三通閥之間的距離以及長度的選擇

靜態化學發光動力曲線結果表明,化學發光強度瞬時能達到較大值,0.5 s達到最大值,3 s后降至空白值。發光試劑與流動相混合處和檢測盤管(檢測盤管是流通池盤管的一部分)之間的接頭距離約2 cm,流量為4 cm·s－1,則此段耗時0.5 s,而該化學發光反應是快速反應,0.5 s時化學發光強度達最大。因此,為了盡可能檢測到強發光時段的化學發光信號,這就要求檢測盤管與三通閥之間的距離盡可能短,試驗將盤管固定在三通閥下底。

增加檢測盤管的長度有利于檢測到更多的光子信號,提高靈敏度及檢出限,但檢測盤管不宜過長,否則色譜峰展寬,使得峰高降低。化學發光持續時間為3 s,流量為4 cm·s－1,故盤管不宜超過12 cm。在相同條件下,分別選擇盤管長度為6,7,8,9,10,11,12 cm 進行試驗。結果表明,盤管長度10 cm 時測得的化學發光強度較大,因此試驗選擇檢測盤管長度為10 cm。

2.3 標準曲線和檢出限

在上述色譜條件和優化的化學發光條件下,對質量濃度分別為1.00,10.00,50.00,100.00,150.00μg·L－1的蘆丁標準溶液系列進行測定。以蘆丁的質量濃度為橫坐標,對應的化學發光強度為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,蘆丁的質量濃度在1.00～150.00μg·L－1內與化學發光強度呈線性關系,線性回歸方程為y＝18.70x＋16.30,相關系數為0.999 2。

以線性范圍的下限作為檢出限,則該方法的檢出限為1.00×10－6g·L－1。將本方法所得的檢出限與文獻中的方法進行比對,結果見表1。

表1 不同方法比對結果Tab.1 Comparison of results by different methods

由表1可知,本方法具有較低的檢出限。

2.4 精密度和回收試驗

按照試驗方法測定50.00μg·L－1的蘆丁標準溶液,平行測定11次,并計算測定值的相對標準偏差(RSD)。結果表明,測定值的RSD 為2.7%,說明方法具有較好的精密度。

按試驗方法對市售蘆丁片劑1～3(標示量50.00 mg·g－1)進行測定,測定值分別為48.60,47.40,48.00 mg·g－1,說明測定值與標示量吻合。對上述樣品進行加標回收試驗,每個樣品平行測定5次,計算回收率,結果見表2。

表2 回收試驗結果(n＝5)Tab.2 Results of test for recovery(n＝5)

本工作建立了化學發光分析與高效液相色譜聯用檢測蘆丁的方法,該方法操作簡單、快速、靈敏度高,能準確地測定實際樣品中蘆丁的含量。