超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定豆芽中12種植物生長調節劑的含量

林守二,鄭仁錦,華永有,黃麗英

(1.福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室,福州 350001;2.福建醫科大學 藥學院,福州 350004)

豆芽具有健脾養肝、清熱解毒等作用,同時含有蛋白質、維生素、糖類以及多種礦物質[1-2]。然而,一些不法商販為牟取高額利潤,在豆芽生產過程中濫用植物生長調節劑(PGRs),企圖增加豆芽產量、改變外觀、縮短生長周期等,以致“毒豆芽”事件頻出[3]。人體攝入PGRs短期內影響不大,但長期食用可能導致各種疾病,輕者刺激黏膜、惡心、嘔吐等,重者引起肢端肥大、骨質疏松、非霍奇金淋巴瘤等[4]。

豆芽中PGRs種類較多,殘留量低,基質復雜,檢測難度較大。目前,用于PGRs檢測的前處理方法主要包括液液萃取、加速溶劑萃取、超聲波提取、微波輔助萃取及固相萃取等[5],其中基質分散固相萃取試劑Qu ECh ERS已成為農藥殘留快速前處理技術的首選[6]。PGRs的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質譜聯用法、液相色譜-串聯質譜法、毛細管電泳色譜法及酶聯免疫法等[7-13]。其中超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)在測定植物中農藥殘留時,檢出限低,受基質干擾小,快速且準確[14-15]。

目前采用UHPLC-MS/MS測定豆芽中PGRs的含量已有報道[16-18],但各文獻所用前處理方法及所檢測目標組分皆有差異,且由于PGRs類化合物各目標組分間性質差異較大,在多組分同時檢測時選用合適的前處理及檢測方法尤為重要。本工作以市售32份豆芽為樣本,應用QuECh ERS快速前處理方法,同時對樣品中12種不同類的PGRs,包括植物生長促進劑類(生長素類)的吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和4-氯苯氧乙酸,細胞分裂素類的6-芐氨基嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、赤霉素,植物生長延緩劑類的矮壯素、抗倒酯、烯效唑、多效唑進行凈化;結合UHPLC-MS/MS檢測技術,對質譜條件的參數進行科學設定,實現了電噴霧離子源(ESI)正負離子的快速切換,一次進樣同時完成ESI正、負檢測,建立了同時測定豆芽中12種PGRs的方法,可用于市售豆芽的快速檢測,易于普及應用,為建立其他食品基質中相關化合物殘留檢測提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

XEVO TQ-XS型超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(Waters I-class 型液相色譜系統,UPLC-XEVO TQ-XS 型質譜系統);Heidolph Multi Reax 型自動渦旋混合器;Beckman Coulter Allegra X-30型離心機;QuECh ERS 試劑管(內含150 mg無水硫酸鎂和50 mg C18)。

單標準儲備溶液:1.00 g·L－1,分別稱取10.00 mg 12種PGRs標準品,用乙腈配制成質量濃度各為1.00 g·L－1的標準儲備溶液。

單標準溶液:10.0 mg·L－1,移取單標準儲備溶液適量,用乙腈稀釋配制成質量濃度為10.0 mg·L－1的單標準溶液。

混合標準溶液:500μg·L－1,移取各單標準溶液適量,用乙腈稀釋,混勻,配制成質量濃度為500μg·L－1的混合標準溶液,于4 ℃冰箱中保存,使用時用乙腈稀釋至所需質量濃度。

12種PGRs標準品矮壯素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、烯效唑、多效唑、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、2,4-D、氯吡脲、赤霉素的純度均大于98%;甲酸、乙腈為色譜純;甲酸銨為優級純;無水硫酸鎂為分析純。

豆芽樣品采集于福州的某超市及農貿市場,所有樣品勻漿后于－18 ℃以下保存備檢。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫30 ℃;流量0.3 mL·min－1;進樣量2μL;流動相A 為含0.1%(體積分數,下同)甲酸的5 mmo L·L－1甲酸銨溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～5.0 min時,B由20%升至90%,保持1.0 min;6.0～6.5 min時,B由90%降至20%,保持1.5 min。

2)質譜條件 ESI源,離子源溫度150 ℃;毛細管電壓2.4 k V;脫溶劑氣溫度500 ℃,脫溶劑氣流量800 L·h－1;錐孔電壓22 V;多反應監測(MRM)模式;矮壯素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、烯效唑、多效唑在電噴霧正離子(ESI＋)模式下檢測;4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、2,4-D、氯吡脲、赤霉素在電噴霧負離子(ESI－)模式下檢測,一次進樣同時完成ESI(±)模式的檢測。12種PGRs的其他質譜參數見表1,其中“?”為定量離子。

表1 12種PGRs的質譜參數Tab.1 MS parameters of 12 PGRs

1.3 試驗方法

稱取5.00 g經勻漿后的樣品于50 mL 離心管中,加入體積比1∶99的乙酸-乙腈混合液10 mL,自動渦旋振蕩2 min,超聲15 min,以轉速6 000 r·min－1離心5min。取上清液1.0mL,加至QuEChERS試劑管內,渦旋后離心5 min,上清液過0.22μm 微孔濾膜,按儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

在儀器工作條件下,12種PGRs的混合標準溶液的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 12種PGRs的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 12 PGRs

2.2 提取劑的選擇

PGRs的常用提取劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等,在提取過程中加入少量酸[19]可提高提取效率。試驗考察了上述常用提取劑對12種PGRs提取效果的影響。結果表明:使用乙腈作為提取劑,各組分均能得到較好的回收率;赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸結構中均含有羧基,酸性溶液抑制羧基在溶液中電離,從而提高提取效率,而乙酸酸性適中,因此最終選用體積比1∶99的乙酸-乙腈混合液作為提取劑。

2.3 凈化劑的選擇

試驗比較了N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和C18等QuECh ERS 試劑的凈化效果。結果發現:加入PSA 使得極性較強的矮壯素以及含有羧基的赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸的回收率降低,與文獻[14,20]報道相符,其原因可能是因為PSA 為堿性,對含有羧酸類的PGRs有吸附作用,故不適合極性較強和含有羧基的PGRs的凈化,適合植物生長延緩劑類抗倒酯、烯效唑、多效唑的凈化;GCB的加入使得氯吡脲、多效唑和烯效唑的回收率明顯降低;而單獨加入C18,所有組分的回收率均大于70.0%。因此,試驗最終選擇C18作為QuECh ERS試劑管內的凈化劑。

2.4 色譜柱的選擇

試驗比較了Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(50mm×2.1 mm,1.7μm)和Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm)對待測組分的分離效果。結果表明,12種PGRs在Waters Acquity UPLC?HSST3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm)上的峰形對稱,響應較好,因此試驗選用Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱。

2.5 質譜條件的選擇

配制100μg·L－1的12 種PGRs混合標準溶液,分別在ESI(±)模式下尋找母離子,并調試各自最佳錐孔電壓及碰撞能量,尋找各組分的二級離子,最終選取豐度較高的2個子離子分別作為定量及定性離子,優化后的具體參數見1.2節中的質譜條件。

2.6 工作曲線和檢出限

12種PGRs均采用基質匹配外標曲線法定量分析,以空白基質配制基質匹配的混合標準溶液。以PGRs的質量分數為橫坐標,對應的定量離子峰面積為縱坐標繪制工作曲線。所得12種PGRs的線性參數見表2。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結果見表2。

由表2可知:所得相關系數均大于0.990 0;檢出限為0.60～6.0μg·kg－1。

表2 線性參數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗

分別選擇不含目標化合物的黃豆芽和綠豆芽的空白樣品,加入低、中、高等3個濃度水平的混合標準溶液,使得矮壯素、6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、烯效唑、多效唑、噻苯隆、2,4-D 和氯吡脲的濃度水平為5.00,10.0,50.0μg·kg－1,吲哚乙酸、吲哚丁酸、4-氯苯氧乙酸、赤霉素的濃度水平為10.0,50.0,100μg·kg－1,按試驗方法測定,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。由表3可知,測得的回收率為70.0%～110%,RSD 為0.21%～9.8%。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.8 樣品分析

按試驗方法對市售32份豆芽樣品進行快速檢測,10 份豆芽樣品中檢出PGRs,總檢出率為31.25%,其中檢出組分為吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-D 和氯吡脲,具體詳見表4。吲哚乙酸是植物內源性生長素之一,其檢出量較高,但尚未見豆芽中吲哚乙酸含量的報道。樣品總檢出率相比于其他文獻報道稍低,但含量范圍與文獻[16-18]測定值相當,表明近些年市售豆芽中PGRs的使用控制良好,但仍需持續監測。

表4 12種PGRs在豆芽中的檢出結果Tab.4 Results of detection of 12 PGRs in bean sprouts

本工作以體積比1∶99的乙酸-乙腈混合液提取豆芽中12種PGRs,并優化選擇以無水硫酸鎂和C18作為Qu ECh ERS凈化劑對提取后的樣品進行凈化,通過調試質譜參數和色譜條件,建立UHPLCMS/MS同時快速測定豆芽中12種PGRs的方法。QuEChERS前處理方法操作簡便、試劑消耗量小、凈化效果好;UHPLC-MS/MS的檢測方法與傳統液相色譜法相比,極大縮短了分析時間,適合于大批量樣品的多組分快速篩查與測定。該方法為快速篩查市場中的“毒豆芽”提供參考。