高效液相色譜法測(cè)定艾拉莫德起始原料中基因毒性雜質(zhì)

朱小華,賀 瓊,吳子旋

(1.常州佳德醫(yī)藥科技有限公司,常州 213164;2.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證學(xué)院,常州 213164)

艾拉莫德為抗炎和抗風(fēng)濕類藥,由日本富山化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社和衛(wèi)材株式會(huì)社聯(lián)合研發(fā),海南先聲藥業(yè)有限公司在我國申報(bào)成功后于2011年上市,商品名為艾得辛,該藥于2019年進(jìn)入國家醫(yī)保,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮為艾拉莫德起始原料之一,該化合物合成過程中會(huì)用到中間體4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚,3種化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 3種化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulae of 3 compounds

4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚結(jié)構(gòu)中含有N-氧化芳香結(jié)構(gòu),為遺傳毒性致癌性物質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)[1],若在工藝中殘留,可能會(huì)引入到艾拉莫德藥品中,患者在服用后將會(huì)對(duì)人體DNA 產(chǎn)生直接或間接的損傷,引起基因突變或體內(nèi)誘變,增加患癌的可能性[2-3]。起始原料的質(zhì)量控制在原料藥注冊(cè)技術(shù)要求中起著重要的作用,各藥審監(jiān)督機(jī)構(gòu)紛紛出臺(tái)了相關(guān)的技術(shù)要求文件[4-10]。因此,應(yīng)對(duì)2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮中4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的殘留量進(jìn)行測(cè)定,并規(guī)定合適的限度。根據(jù)歐洲藥品管理局(EMA)?遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則?規(guī)定的限度,人體遺傳毒性雜質(zhì)的攝入量不能超過1.5μg·d－1,艾拉莫德片臨床服藥劑量為50 mg·d－1,計(jì)算得到艾拉莫德原料藥中基因毒性雜質(zhì)不得過30μg·g－1[11-12]。故擬定4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的合量限量為30μg·g－1。目前,除了公布了熔點(diǎn)和核磁的數(shù)據(jù)[13-16],國內(nèi)對(duì)于4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的檢測(cè)研究報(bào)道的較少。雖然色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高,更適用于檢測(cè)限量要求低的基因毒性雜質(zhì),但是4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚結(jié)構(gòu)中均有硝基,在質(zhì)譜中響應(yīng)較低,故本工作建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮中4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的殘留量的方法,以期為這2種基因毒性雜質(zhì)含量的監(jiān)控提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配光電二極管陣列檢測(cè)器。

4-氯-3-硝基苯甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:稱取適量4-氯-3-硝基苯甲醚對(duì)照品,用乙腈溶解并稀釋配制成3 g·L－1對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

3-硝基-4-苯氧基苯甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:稱取適量3-硝基-4-苯氧基苯甲醚對(duì)照品,用乙腈溶解并稀釋配制成3 g·L－1對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:取適量4-氯-3-硝基苯甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,用35%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液稀釋配制成21,30,39 mg·L－1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液A、B、C。

對(duì)照品溶液:取適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液B,用35%乙腈溶液稀釋配制成0.3 mg·L－1的對(duì)照品溶液。

4-氯-3-硝基苯甲醚對(duì)照品的純度為99.9%;3-硝基-4-苯氧基苯甲醚對(duì)照品的純度為97.8%;乙腈為色譜純;磷酸、氨水為分析純;試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮供試品由常州佳德醫(yī)藥科技有限公司提供,批號(hào)分別為20190501、20190601、20190701。

1.2 儀器工作條件

Wondasil C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);柱溫為35℃;流動(dòng)相A為乙腈,B為0.01mol·L－1磷酸鹽緩沖液(pH9.0,由磷酸和氨水混合而成);流量為1.0mL·min－1;進(jìn)樣量20μL;檢測(cè)波長222 nm。梯度洗脫程序:0～5 min時(shí),A 為40%;5～45 min時(shí),A 由40%升至70%,保持5 min。

1.3 試驗(yàn)方法

取供試品約100 mg,用35%乙腈溶液9 mL于50 ℃水浴中超聲溶解,加入0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液1 mL,搖勻后靜置,冷卻至室溫,在冰水浴析晶約30 min。取上清液1～2 mL,用0.45μm 濾膜過濾,濾液(供試品溶液)供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

由于供試品中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮含量較高,會(huì)導(dǎo)致色譜柱和檢測(cè)器超載,進(jìn)而影響目標(biāo)物的測(cè)定,故試驗(yàn)依次采用合適的溶劑溶解樣品、冰水浴析晶、濾膜過濾等方式來降低其含量。

溶劑的選擇很關(guān)鍵,不僅要求其能溶解供試品,還能夠保證2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮在冰水浴中充分析晶,經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),選擇的溶劑為35%乙腈溶液。

2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮為中性化合物,其在酸性環(huán)境中容易結(jié)晶,故試驗(yàn)比較了分別加入1 mL 水、0.05%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.3%磷酸溶液,冰水浴析晶后濾液中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮的含量。結(jié)果顯示:當(dāng)加入0.2%磷酸溶液和0.3%磷酸溶液后,濾液中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮的含量較低。綜合考慮,試驗(yàn)選擇加入0.2%磷酸溶液1 mL。

2.2 檢測(cè)波長的選擇

按照儀器工作條件分析混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液B,在波長190～500 nm 內(nèi)進(jìn)行紫外-可見掃描,所得光譜圖見圖2。

由圖2可知:2種目標(biāo)物均在波長222 nm 處有較大吸收,故試驗(yàn)選擇的檢測(cè)波長為222 nm。

圖2 4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的紫外-可見光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of 4-chloro-3-nitroanisole and 3-nitro-4-phenoxyanisole

2.3 色譜柱的選擇

試驗(yàn)分別考察了InertSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Kramosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等3種色譜柱對(duì)2種目標(biāo)物的分離效果的影響。結(jié)果顯示:用Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)進(jìn)行分離時(shí),酸度適用范圍較寬(pH 1～10),供試品溶液中其他雜質(zhì)對(duì)2 種目標(biāo)物的測(cè)定干擾較小,可滿足要求。

2.4 專屬性試驗(yàn)

按照儀器工作條件測(cè)定對(duì)照品溶液、供試品溶液和35%乙腈溶液,色譜圖見圖3。

圖3 對(duì)照品溶液、供試品溶液和35%乙腈溶液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of reference solution,test solution and 35%acetonitrile solution

由圖3可知:供試品中2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮可與4-氯-3-硝基苯甲醚、3-硝基-4-苯氧基苯甲醚完全分離,保留時(shí)間分別為10.051,24.004,33.300 min;溶劑35%乙腈溶液及樣品中其他雜質(zhì)對(duì)2種目標(biāo)物的測(cè)定無干擾,說明本方法的專屬性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將新鮮制備的對(duì)照品溶液分別放置0,1,2,4,8,12,16,24 h后注入色譜儀,按照儀器工作條件測(cè)定。結(jié)果顯示:4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.3%,1.2%,說明這2種目標(biāo)物在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

用35%乙腈溶液將4-氯-3-硝基苯甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋配制成的0.03,0.10,0.20,0.30,0.45,0.60 mg·L－1混合對(duì)照品溶液系列,以2種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:這2種目標(biāo)物的線性范圍均為0.03～0.60 mg·L－1,線性回歸方程分別為y＝92.95x－0.520 8和y＝93.30x＋0.745 2,相關(guān)系數(shù)均為0.999 7。

分別以3倍、10倍信噪比(S/N)計(jì)算4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),所得檢出限分別為9.97,10.04μg·L－1,測(cè)定下限分別為33.20,33.47μg·L－1。

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 重復(fù)性

按照試驗(yàn)方法配制6份加標(biāo)供試品溶液(2種目標(biāo)物的加標(biāo)量為0.30μg),平行分析6次,4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚測(cè)定值的RSD 分別為3.2%,4.5%。

2.7.2 中間精密度

參照?中華人民共和國藥典?(2020年版)于重復(fù)性試驗(yàn)的第2 天由另一位檢驗(yàn)員在島津LC-20AD 型液相色譜儀按2.7.1節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn),計(jì)算2 d所得的12組數(shù)據(jù)的RSD,4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的RSD 分別為4.4%,6.2%,表明該方法具有良好的中間精密度。

2.8 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)供試品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of test for recovery

由表1可知:4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的回收率分別為94.5%～104%和89.0%～104%。

2.9 耐用性試驗(yàn)

適當(dāng)調(diào)整色譜條件參數(shù)[緩沖液pH (9.0±0.1)、流量(1.0±0.1)m L·min－1、同型號(hào)不同批號(hào)色譜柱],按照儀器工作條件分析供試品溶液和對(duì)照品溶液。結(jié)果顯示,當(dāng)色譜條件參數(shù)發(fā)生較小變動(dòng)時(shí),對(duì)4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚的測(cè)定無明顯影響,說明本法具有良好的耐用性。

2.10 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析3批供試品,均未檢出3-硝基-4-苯氧基苯甲醚,檢出的4-氯-3-硝基苯甲醚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.46,3.94,4.12μg·g－1。

本工作建立了高效液相色譜法測(cè)定2-甲氧基-4-甲磺酰胺基-5-苯氧基苯乙酮中基因毒性雜質(zhì)4-氯-3-硝基苯甲醚和3-硝基-4-苯氧基苯甲醚含量的方法,該方法具有成本低廉、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),可廣泛應(yīng)用于艾拉莫德生產(chǎn)行業(yè)。