DPEP1基因過表達BT549細胞株的建立和鑒定

鄭美玲，魏春莉，劉曉燕，傅俊江

西南醫科大學醫學基礎研究中心·四川省高校表觀遺傳與腫瘤重點實驗室（瀘州 646000）

腫瘤是機體在各種異常因素作用下產生的新生物，其中惡性腫瘤為醫療界的一大難題，它嚴重威脅人類的生命健康，是全球發病率和死亡率的主要原因之一，其中50歲以上女性乳腺癌發生率為80%以上。據統計，在目前已知的各種惡性腫瘤中，由于絕大多數患者對該病不夠重視，社會科普體系不健全及醫院早期診斷、治療機制不完善等客觀因素無法在短時間內解決，也在很大程度上增加了惡性腫瘤的病死率[1-3]。同時由于腫瘤的致病因素、易感基因、腫瘤轉移、相同腫瘤的不同類型和血管生成機制等與該病有關的各種因素尚未完全清楚[3]，也在某種程度上阻礙了上述各種客觀因素的有序推進。

值得注意的是，既往研究中所構建二肽酶1（de?hydropeptidase-1，DPEP1）基因表達載體研究與DPEP1 蛋白表達相關研究[4]，揭示DPEP1 的某些生物學新功能與大腸癌、結腸癌中呈高表達的同時還與其癌癥病理標本和負相關參數的侵略性和不良預后均有密切相關。DPEP1 可能通過降解基質屏障來促進細胞遷移和血管生成[5]。同時也有研究證實，DPEP1 的這種新生物學特性在腫瘤的癌細胞轉移、侵襲中也存在。既往研究還證實[6]，腫瘤細胞侵襲性也會受DPEP1 的過度表達抑制，吉西他濱（gem?citabine），一種化學治療劑，治療時的敏感性也會在DPEP1 的影響下遞增，表皮細胞生長因子（epider?mal growth factor，EGF）治療可減少DPEP1表達。

DPEP1 基因（NM_004413.4）屬于肽酶M19 家庭，它定位于人類染色體16q24.3。DPEP1長度為28 233堿基對，含9 個外顯子和8 個內含子；它編碼411 氨基酸，預測分子量為45 674道爾頓。

研究DPEP1 調控蛋白水平、穩定性和在腫瘤癌細胞轉移、侵襲中的作用，對拓展腫瘤新的治療靶點、靶標等具有重要意義，也可為腫瘤的實驗研究提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

1.1.1 試劑DMEM培養基、RPMI 1640培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和Opti-MEM培養基購自GIBCO 公司；EcoR V 和Nhe I 購自BIO-RAD；DPEP1 質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司；One-Step RT-PCR Kit及PCR產物回收試劑盒（德國QIAGEN公司）、Taq plus DNA聚合酶（上海生工生物工程公司）、Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）、Cell Counting Kit-8 試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學研究所等，其他試劑盒則參照使用說明書。載體pcD?NA5/FRT/TO、大腸桿菌DH5α、HEK-293 細胞系、HeLa細胞系、MDA-MB-231細胞系、BT549細胞系、潮霉素B、氨芐青霉素由本實驗室保存。

1.1.2 主要儀器熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：IX81）、超低溫冰箱（美國Thermo公司）、高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）、熒光實時定量PCR 儀及PCR 分析儀（美國ABI 公司）、BIO-RAD 雙向電泳分析系統（美國伯樂公司，型號：Bio-Rad Mini-protean Tetra cell）、全波長酶標儀（美國Thermo公司）等。

1.2 方法

1.2.1 實驗步驟設計實驗方案（見圖1）后按相關步驟開展各項實驗。①應用Primer Express 2.0 軟件設計DPEP1（NCBI基因庫序列號：NM_004413）引物和探針獲取DPEP1 的cDNA 序列（見表1）。②實驗步驟：以已有DPEP1 cDNA基因為模板進行高保-聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增DPEP1 全長基因。將pcDNA5/FRT/T0 表達載體用EcoR V和Nhe I雙酶切消化后與相同內切酶消化的DPEP1 連接，并獲取pcDNA5/FRT/T0/DPEP1。接著進行陽性克隆篩選以獲得陽性克隆。最后轉染細胞系過表達，并應用Western blot檢測DPEP1的表達情況。

表1 DPEP1引物序列表

1.2.2 PCR擴增及克隆①反應條件：95 ℃預變性1.5 min，94 ℃40 s、65 ℃30 s、72 ℃2 min 進行35 個循環，接著在72℃條件下延伸2 min，16 ℃保存。②PCR 產物純化：所有的PCR 產物均經EcoR V、Nhe I雙酶切后膠回收純化處理，然后連入載體并轉化至大腸桿菌DH5α中并隨機挑選克隆提質粒和電泳，鑒定并將初篩的陽性克隆菌液進行基因測序（Sanger測序法）。重組質粒命名為pcDNA5-DPEP1。

1.2.3 DPEP1 質粒的擴增和提取將重組質粒DPEP1克隆于氨芐青霉素陽性的LB（Luria-Bertani）培養基（37 ℃）中過夜，培養結束后提取質粒。進行瓊脂糖電泳檢測質粒提取質量。

1.2.4 細胞轉染及構建細胞系將在含有完全培養基DMEM，10%胎牛血清的12 孔培養基中培養的HeLa 和BT549 細胞密度達到70%左右時，采用脂質體轉染法將構建的pcDNA5-DPEP1 質粒和pcDNA5質粒分別共轉染細胞。取3支已滅菌1.5 mL離心管，向各管分別加入OPTI-MEM、質粒、空質粒，再按順序分別加入Lipofectamine?3000、P3000?、P3000?后，室溫靜置10 min，再將含有Lipofectamine?3000混合液均分至另外兩支管并混勻，室溫靜置10 min。處理細胞后，加入50 μL OPTI-MEM培養基，再緩慢加入已靜置10 min 的DNA-Lipofectamine?3000 復合物，水平前后左右輕輕推動培養板各2 次混勻并在培養板上做好標記后，將培養板放置在37 ℃CO2孵育箱中培養。培養6 h后，吸出培養液，每孔加入含有10%胎牛血清的培養基1mL；觀察細胞情況，第2～3 d 將細胞傳代[7-13]。潮霉素B 篩選細胞系，獲得潮霉素B抗性細胞系。

1.2.5 蛋白質免疫印跡雜交（Western Blot）將細胞蛋白裂解液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro?pheresis，SDS-PAGE），10%分離膠，5%濃縮膠，蛋白質電泳至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脫脂牛奶封膜，搖床1.5 h，分別加入FLAG 或DPEP1 和HSP70 抗體（1∶5 000），搖床4 ℃過夜；再用1×TBST 洗膜3 次，10 min/次。用顯影液在凝膠圖像成像儀曝光，從而用FLAG 抗體和DPEP1 抗體分別檢測DPEP1 蛋白是否成功過表達。HSP70作為內參蛋白[11-15]。

1.2.6 CCK-8 法檢測過表達細胞系CCK-8 是Cell Counting Kit-8 的簡稱。將轉染細胞按70%左右的密度接種到96孔板，100 μL/孔。DPEP1質粒組、空質粒組、對照組、空白組均設置7 個平行孔，24 h 后加入10 μL/孔的CCK-8 溶液，培養2 h 后，置于全長酶標儀450 nm處測各孔的吸光度（OD值）[16-18]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 DPEP1 cDNA擴增

以DPEP1 基因的cDNA 作為模板，高保真PCR多聚酶擴增，獲得DPEP1 基因片段，再經用EcoR V和Nhe I雙酶切消化后和純化，獲得用于克隆中連接所需要的純化DPEP1片段。

2.2 鑒定重組質粒pcDNA5-DPEP1

采用PCR檢測和EcoR V和Nhe I雙酶切消化與相同內切酶消化的DPEP1重組質粒pcDNA5-DPEP1，獲得pcDNA5/FRT/TO/DPEP1，得到與理論片段相符的1 個質粒。圖2A 是陽性克隆經PCR 鑒定結果（黑色箭頭標示所擴增的開放閱讀框片段大小）；圖2B是陽性克隆經EcoR V 和Nhe I 雙酶切鑒定的結果（紅色箭頭標示所酶切的DPEP1 片段）。然后進行Sanger 測序分析，該基因的Sanger 測序分析證明其與DPEP1（NCBI 基因庫序列號：NM_004413.4；1 233 bp）序列一致（結果未顯示）。

圖2 DPEP1基因陽性克隆的PCR（A）和酶切鑒定（B）

2.3 DPEP1蛋白過表達分析

構建過表達DPEP1 質粒pcDNA5-DPEP1 并成功構建穩定細胞系BT549，提取蛋白進行Western blot 分析，結果顯示我們成功地檢測到DPEP1 蛋白的過表達（圖3A，通道1 和2），而陰性對照無表達（圖3A，通道Ctrl）。經對目的蛋白DPEP1 過表達的WB條帶灰度值進行分析，通道1的值約是通道對照組（ctrl）的20.16 倍，通道2 的值約是ctrl 的18.13 倍（圖3B）。DPEP1蛋白過表達成功證明建立了穩定表達細胞系。

圖3 DPEP1蛋白的過表達及WB條帶灰度分析

2.4 DPEP1的生長分析

過表達DPEP1 細胞系進行CCK-8 檢測，BT549過表達組吸光度與其他轉染組細胞系進行吸光度分析。其結果以不同組為橫坐標、OD 值為縱坐標作柱狀圖顯示（圖4）。DPEP1 過表達組與非DPEP1 過表達對照組、空載體質粒組之間的OD 值差異不大（分別為P=0.054，P=0.092，P=0.87），無統計學意義（P>0.05），證明DPEP1對腫瘤細胞生長無影響。

圖4 DPEP1質粒轉染細胞的OD值柱狀圖

3 討論

據統計，在導致乳腺癌發生的各種危險因素（如未婚，未育，晚育，未哺乳等）中經期的早（月經初潮<12歲）、遲（絕經>55歲）尤顯著，結腸癌主要以腹脹、消化不良、排便習慣改變等消化道癥狀為主，而子宮頸癌中的陰道不規則流血、排液、疼痛為主要表現，婦科檢查可見宮頸糜爛、潰瘍或菜花狀新生物尤為突出，當然與腫瘤相關的突變基因、易感基因對其有調控作用，機體攜帶與相關基因也是可能存在的潛在危險[19-23]。乳腺癌是最常見的癌癥，也是全世界各地女性因癌癥致死的主要原因以及診斷頻率最高、根治性差的癌癥[18-19]。對于惡性腫瘤的發病機制及對惡性腫瘤未來的治療方向，主要是將促使癌癥發生、發展、轉移的基因和途徑與在其發展中不發揮作用的基因和途徑進行區分，及新型靶向治療的研究，而DPEP1的研究作為目前腫瘤生物醫學研究領域中探討乳腺癌致病因素及治療新切入靶點之一，有其研究的必要性與迫切性。

作為肽酶M19 家庭的重要成員之一的DPEP1，臨床上又將其稱作神二肽酶或膜二肽酶、微粒體二肽酶。既往研究表明[24-27]，DPEP1在結腸癌、大腸癌等癌組織中的表達情況均顯著高于正常組織，其表達隨病理分化程度的降低而降低，也隨淋巴結和遠處轉移情況的下降而下降。研究發現，即使DPEP1 在結腸癌、大腸癌等癌組織中呈低表達，但其整體預后效果不是非常顯著，當然這在那些根治性手術患者中依舊如此[13，28-30]。

本文以DPEP1 的cDNA 基因作為模板，高保真PCR 多聚酶擴增而獲得DPEP1 基因片段，再用EcoR V 和Nhe I 雙酶切消化和純化，最終獲得的DPEP1 cDNA 基因序列與DPEP1（NCBI 基因庫序列號：NM_004413）序列相符。且重組DPEP1 蛋白后獲得了與理論片段相符的質粒。而在RAPD 技術腫瘤組織分析中也發現，乳腺癌中的DPEP1 表達有顯著的異常擴增特征[26-31]，提示DPEP1 可能影響腫瘤患者的癌細胞的侵襲性而改變寄主細胞原有的性狀或癌細胞的產生提供便利，以及癌細胞的轉移起到促進作用，這可能與DPEP1 蛋白在腫瘤細胞中存在過表達現象有關[7，20，29]。在分子生物學研究中，通常需要基因/蛋白質的所需表達[26]。上述研究均證實，DPEP1蛋白在腫瘤細胞中能顯著的過表達現象。而既往研究[32-34]中的DPEP1 cDNA（結直腸上皮內癌變組織）和蛋白表達情況與病理特征對比分析也發現，二者的表達趨勢有顯著的一致性，且DPEP1 蛋白水平越高其癌變組織發生癌變的可能性也越高。同時也有研究表明[35-36]，DPEP1 的過表達通過激活PI3K/Akt/mTOR使原本沉默的DPEP1在肝母細胞瘤中起到癌基因的作用。腫瘤癌變進程中表觀遺傳學的變化能引起抑癌基因失活與原癌基因活化，對不同腫瘤的發生發展、侵襲轉移起關鍵性作用[7，37-41]。結合上述研究可以推斷，腫瘤患者的DPEP1 表達量升高是隨著腫瘤病變的發生、發展而逐漸發生轉變的，DPEP1表達在乳腺癌的腫瘤演進機制中發揮了重要作用。DPEP1在惡性腫瘤的瘤變過程中存在顯著的過表達特征，且影響腫瘤細胞的侵襲性。

綜上所述，此次實驗成功構建DPEP1 過表達載體并成功構建乳腺癌BT549 穩定細胞系，并檢測到了DPEP1 蛋白過表達，對下游調控信號通路及DPEP1 功能的研究可能非常有用。推測DPEP1 在惡性腫瘤的病變過程中可能誘導正常細胞轉變為癌細胞，可能是惡性腫瘤潛在的一個新治療靶點。但仍需更多的研究予以證實，而本研究為將來闡明DPEP1基因在腫瘤中的作用及機制奠定實驗基礎。

4 結論

本研究成功構建了DPEP1 的過表達載體及穩定細胞株，并獲得DPEP1 蛋白的過表達。該研究的成功實施為深入闡明DPEP1 在腫瘤中的作用機制奠定了前期實驗基礎。