篩選兩萬個人類基因，耶魯團隊發現介導蛋白，采用“洗衣液”原理規避耐藥性，直接殺滅侵入性細菌

為什么感冒的時候，吃了很多藥病情卻不見好轉？最主要原因之一，是人們長期食用抗生素類型的感冒藥，使人體中許多病原體產生抗藥性。在免疫學中，如何高效的殺死革蘭氏陰性菌、如沙門氏桿菌等具有很強抗藥性的細菌，是一件令人頭痛的問題。

近日，耶魯大學醫學院研究團隊發現了一種名為“APOL3（Apolipoprotein L3）”的介導蛋白，該蛋白可以像商場中售賣的“洗手液”去污一樣，簡單粗暴地將入侵人體內的病原微生物殺死，還不會對人體自身造成傷害。

該團隊將研究目光聚焦在人體內自身的自主免疫系統，研究發現該系統中“干擾素刺激蛋白”能夠以簡單高效的方式，將病原微生物清除。

相關論文以題為《具有類似洗滌劑的活性人體介導蛋白L可殺死細胞內病原體》，發表在國際期刊《科學》上。

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該研究由耶魯大學醫學院霍華德休斯醫學院博士后瑞安·高德、耶魯大學系統生物學研究所博士后朱世偉，耶魯大學醫學院微生物發病機理學和免疫生物學副教授約翰·麥克米金主導。

朱世偉

負染電子顯微鏡顯示APOL3直接破壞細菌內膜

該研究成果揭示了APOL3可以通過其兩親螺旋以及跨膜結構域直接和細菌內膜中的磷脂成分結合，并形成具有動態屬性的納米磷脂環，就像“洗手液”去污一樣將細菌內膜磷脂溶解，破壞細菌內膜的完整性，導致細菌的死亡。

所以，只要APOL3蛋白有機會接觸到病原細菌的內膜，就可以用簡單粗暴的方式將侵入人體的細菌殺死。

病原細菌的抗藥性是難以解決的科學問題之一。該研究一針見血地強調，人類自身可以進化出簡單高效的自我防衛策略APOL3天然“去污劑”。體內增強APOL3的表達水平與體外抗生素結合使用，對于治療具有耐藥性病原菌感染具有潛在應用價值。

對2萬個人類基因進行篩選，進一步闡明APOL3的抗菌機制

人體細胞內儲存了豐富的營養物質，因此自然界中許多病原微生物、細菌、寄生蟲選擇在細胞內增殖。

過去人們普遍認為機體主要靠免疫細胞來清除細菌感染。然而，近年來發現表明，占機體絕大多數的非免疫細胞也可以通過細胞自主免疫來遲滯和清除侵入細胞內的病原體。

Ⅱ型干擾素（IFN-γ）通過上調大量干擾素刺激基因的表達，在調控細胞自主免疫中扮演了重要角色，但里面有很多基因功能及其抗菌機制并沒有被揭示。為了找到非免疫細胞中抵御細胞內細菌感染的關鍵基因，該團隊采用CRISPR/Cas9系統對2萬個人類基因進行了篩選。

CRISPR-Cas9技術對APOL3的篩選示意圖

CRISPR-Cas9技術對APOL3的篩選示意圖

APOL3可以將細胞內的病毒殺死

APOL3通過更加高效地結合并溶解細菌內膜的酸性磷脂組分，像“去污劑”一樣簡單粗暴地將細菌殺死，這一研究結論增強了人們對非經典免疫系統的認知。

但是，IFN-γ在非免疫細胞和組織中所賦予的抵抗力至今仍難以捉摸。

首先，由于非免疫細胞常常被視為與免疫系統無關而得不到重視。其次，在上皮細胞中，IFN-γ信號介導刺激大量相關的基因產物表達，其中很多基因表達產物的功能及其抗菌機制并沒有被揭示。因此，IFN-γ在非免疫細胞和組織介導免疫防御機制仍難以捉摸。

負染電子顯微鏡顯，顯示APPOL3和納米磷脂環的形成

首先，用慢病毒搭載Cas9以及全基因組sgRNA（single guide RNAs）文庫對HeLa細胞進行轉導。

其次，使用干擾素激活這些細胞中ISGs的表達，并進一步用熒光標記過的沙門氏菌去感染這些HeLa細胞。

最后，通過流式細胞術分選出沙門氏菌高度增殖的HeLa細胞群體，并通過高通量測序鑒別出特異富集在這一細胞類群中的sgRNA。

該團隊運用了全基因組CRISPR/Cas9篩選體外脂質體實驗，揭示了非免疫細胞的全新自我防御機制。

朱世偉表示，“首先，我們發現APOL3能夠顯著抑制諸如沙門氏菌在內的胞內病原菌增殖。其次，我們采用高分辨熒光顯微鏡、負染電子顯微鏡、冷凍電子顯微鏡以及質譜等多種手段進一步闡明了APOL3的抗菌機制。”

該團隊之所以選擇“沙門氏桿菌”作為研究載體，是因為它對于此項研究工作的推動有實質性幫助。

第一，沙門氏菌是一種常見的食源性病原微生物，能夠引起食物中毒。中毒情況嚴重時，可導致誤食者死亡。闡明沙門氏菌與宿主細胞的相互作用，有助于我們預防以及治療其引起的疾病。

第二，沙門氏菌是研究細胞內感染機制的重要模式生物，科學界對沙門氏菌本身的生理特性有著相對完善的認知，也開發了研究諸如突變菌株、基因表達菌株等細菌的多種工具。

結果顯示：針對APOL3基因的數個sgRNA在其中高度富集，提示敲除APOL3會引起沙門氏菌在HeLa CCL2細胞內過度增殖。

體內“洗手液”APOL3，可以簡單粗暴的方式將侵入性細菌殺死

朱世偉表示，“我們這篇研究的亮點之一，是再次提出人體表皮、上皮各種細胞都具有防疫免疫功能，我們發現如果Ⅱ型干擾素受到外援細菌入侵，它的表達就會升高，會自動調動人體的一些相關的基因。”

該團隊通過活細胞顯微成像技術對APOL3進行了跟蹤，發現APOL3能夠迅速轉移至暴露的細菌中，這是APOL其他蛋白所不具備的特征。超分辨熒光成像顯示當APOL3靶向IFG-g激活細胞內的病原體時，會對細菌內膜造成致命的傷害。

譬如，在治療由病原菌感染引起的病患時，

由于很多病原菌具有抗生素抗藥性，所以抗生素很難將它們徹底殺死。在這種情況下，先對患者的免疫系統進行調控是一種行之有效的辦法。當患者的自身免疫能力提高，就能夠有效將這些具有抗藥性的病原體殺死。

然而，APOL3作為一種強效的殺菌武器是受嚴格調控的。在靜息狀態下，APOL3的表達量非常低。當細菌入侵時，人體會分泌出干擾素IFNI-γ作為一種警示信號誘導細胞大量表達APOL3以及其他相應蛋白。APOL3需要與鳥苷酸結合蛋白（GBP1，Guanylate-Binding Protein 1）蛋白協同作用，以發揮最大功效，從而擊穿細菌外膜脂多糖，幫助APOL3接觸到細菌內膜直接將侵入人體的細菌殺死。

進一步探索人免疫系統的奧秘，讓患者遠離抗生素

朱世偉做了一個形象生動的比喻，“APOL3與病原體有點像中國文化里的‘道和魔此消彼長，整個免疫系統又像一個宇宙，有許多奧秘需要探索，除了洗手液A，可能還有洗手液B或者C，本次研究僅僅是一個開端，后面還有很多寶藏有待挖掘。”

就人體細胞而言，還有其它的IFN-γ信號介導效應蛋白有必要了解，其它的效應蛋白也有著類似APOL3的抗菌功能。“我需要分別從細胞和分子水平上，解析類似APOL3相關蛋白的結構，進一步揭示抗菌機制。”朱世偉表示。

由于病原菌病原體的進化速度遠遠快于抗生素的發明和新型類抗生素的尋找，當患者受到抗藥性病原菌感染之時，有針對性地增強患者自身干擾素介導的效應蛋白表達，或許是對抗抗藥性病原菌感染，挽救患者生命的另一種可行方案。

接下來，該團隊將研究還有哪些干擾素刺激基因蛋白真正參與了直接殺菌;比如，該團隊目前所關注的鳥苷酸結合蛋白，是如何識別病原微生物外膜并將其破壞掉的;是否可以采用體外重構的方式來模擬多種干擾素介導的效應蛋白協同工作，消滅病原微生物;是否可以利用冷凍電鏡在細胞和分子水平上揭示這些效應蛋白的殺菌機制。這將是該團隊未來2年～3年內攻克的主要難題。

打破前進道路中的“枷鎖”，勇攀科研高峰

據悉，朱世偉博士期間專注于細菌學領域中鞭毛馬達組裝與結構的研究，為了獲得原位鞭毛馬達3D結構信息，朱世偉飄洋過海到耶魯大學學習冷凍電子顯微鏡、冷凍電子斷層掃描以及后期圖像處理技術。后來，他發表了細菌鞭毛馬達一系列的原位3D結構（PNAS，114（41），10966-10971）。

“結合我的細菌學背景以及所掌握的冷凍電鏡及后期圖像處理技術，我選擇了細菌學和免疫學互相交叉的細胞自主免疫作為主要研究方向。使用冷凍電子斷層掃描技術和冷凍電鏡單顆粒技術，分別在細胞和原子水平上，揭示解析細胞自主免疫過程中IFN-γ信號介導的相關效應蛋白抗菌機制。”朱世偉表示。

最近，該團隊首次發現了植物可以通過相分離的方式來增強自主免疫防御。朱世偉利用冷凍電子斷層掃描技術，第一次在原位上捕捉到相分離的結構，并以此為依據提出了以相分離為介導的植物自主防御模型（Nature 594（7863），424-429）。真核生物可以采用多種多樣的策略去抵抗病原菌入侵，這一系列研究結果拓寬了朱世偉對自主免疫防御的認知。

朱世偉表示：“科研之路挑戰在所難免，我們要勇于打破前進道路上的枷鎖，永攀科學高峰，為推動該研究領域的蓬勃發展提供一份力量。”（摘自美《深科技》）

（編輯/費勒萌）