L-亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

奚逢源 胡倩 薛長(zhǎng)艷 季芳琴

摘 要：試驗(yàn)用黃色短桿菌FY-18作為菌種，用搖瓶進(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)L-亮氨酸;通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)對(duì)培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)的組合;通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，篩選出最適合黃色短桿菌FY-18生長(zhǎng)的培養(yǎng)基主要成分，即葡萄糖∶硫酸銨=24.00∶6.00、玉米漿干粉12.00 g/L、磷酸二氫鉀0.60 g/L、二次谷氨酸母液10 mL/L。最佳的培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)溫度36 ℃、pH為7.2、溶氧量20%、接種量15%。在最佳條件下，產(chǎn)量最高達(dá)到24.68 g/L。

關(guān)鍵詞：黃色短桿菌FY-18;L-亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基;培養(yǎng)條件;正交單因素試驗(yàn)

亮氨酸是最有效的一種支鏈氨基酸，能夠快速分解轉(zhuǎn)化為葡萄糖。增加葡萄糖可以防止肌肉組織受損，因此特別適合健美運(yùn)動(dòng)員[1]。亮氨酸還能提高生長(zhǎng)激素的產(chǎn)量，并幫助燃燒內(nèi)臟脂肪，促進(jìn)骨骼、皮膚以及受損肌肉組織的愈合。由于亮氨酸很容易轉(zhuǎn)化為葡萄糖，有助于調(diào)節(jié)血糖水? ?平[2]。亮氨酸的食物來(lái)源包括糙米、豆類(lèi)、肉類(lèi)、堅(jiān)果、大豆粉和全麥，是一種必不可少的氨基酸，且只能通過(guò)飲食獲得。因此，選擇混合型補(bǔ)充劑更方便。但是，攝入過(guò)量的亮氨酸也會(huì)產(chǎn)生副作用，已知大量攝入會(huì)引起皮炎、腹瀉、精神失常等問(wèn)題。飲食中含有過(guò)多亮氨酸還會(huì)增加體內(nèi)的氨，并破壞肝、腎功能[3]。因此，除非咨詢(xún)過(guò)醫(yī)生，肝或腎功能受損患者不應(yīng)該攝入大劑量的亮氨酸，否則會(huì)導(dǎo)致病情惡化。

鑒于L-亮氨酸代謝生產(chǎn)難度大，在我國(guó)應(yīng)用行之有效的生產(chǎn)方式具有非常重要的意義[4]。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)L-亮氨酸的菌種產(chǎn)酸偏低、價(jià)格高、發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)量較低，主要用于配制復(fù)方氨基酸輸液。為了提高L-亮氨酸發(fā)酵水平，進(jìn)行L-亮氨酸菌種選育和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化具有重大研究意義。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)亮氨酸的需求日益增長(zhǎng)，必須改進(jìn)亮氨酸生物合成的工藝，優(yōu)化亮氨酸的培養(yǎng)基，使其達(dá)到較高的產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益。改進(jìn)亮氨酸的制作工藝可以從黃色短桿菌FY-18的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件兩個(gè)方向進(jìn)行[5]。微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成是保證高產(chǎn)菌株的高產(chǎn)性能得以充分表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在培養(yǎng)過(guò)程中篩選出5種重要成分，采用正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)篩選出最佳組合。

1?材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 供試菌種

采用黃色短桿菌FY-18為出發(fā)菌株，由臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院菌種保藏室保藏。

1.1.2? 儀器設(shè)備

生物傳感分析儀（SBA-40C）、錐形瓶、10 mL試管、振蕩器（培英DZ-900）、高效液相色譜儀、20 mL培養(yǎng)皿、可見(jiàn)分光光度計(jì)（7230G）、燒杯、滴管。

1.1.3? 培養(yǎng)基

100 mL液體搖瓶培養(yǎng)基：100 mg二次谷氨酸母液，3.00 g葡萄糖，0.50 g硫酸鎂，0.50 g磷酸氫二鉀，0.02 g硫酸亞鐵，0.50 g玉米漿干粉，0.05 g硫酸銨，40 mg蛋氨酸，4.00 g谷氨酸，1.00 g硫酸鎂，1.50 g瓊脂粉。

100 mL發(fā)酵液體搖瓶培養(yǎng)基：0.02 g硫酸亞鐵，15.00 g葡萄糖，2.00 g二次谷氨酸母液，7.00 g硫酸銨，0.05 g磷酸氫二鉀，1.50 g毛發(fā)粉，60 mg蛋氨酸，2.00 g玉米漿干粉。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 種子試管斜面培養(yǎng)菌的培養(yǎng)方法

在搖瓶培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉制作試管斜面培養(yǎng)基，加熱融化后，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，冷卻至80 ℃，再倒入試管封裝，試管的液面不得超過(guò)1/3。裝好后用牛皮紙包扎，放入蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。滅菌后，傾斜放至凝固，斜面不得超過(guò)2/3。再用接種針劃線(xiàn)接種，在恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)24 h，待用。

1.2.2? 種子搖瓶液體培養(yǎng)菌的培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)基的成分分別溶解后加入，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，封裝在250 mL搖瓶中，用牛皮紙包扎好，在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。等待冷卻至50 ℃，每瓶放入4～5顆玻璃珠，在超凈臺(tái)上用接種環(huán)選取斜面的菌種接種到搖瓶中，裝液量為200 mL。再放到搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為32 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min，種子的合格條件為培養(yǎng)時(shí)間約24 h、菌體OD值（620 nm）為1.2。

1.2.3? 發(fā)酵液體搖瓶培養(yǎng)菌的培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)基的成分分別溶解后加入，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，封裝在500 mL搖瓶中，用牛皮紙包扎好，在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。等待冷卻至50 ℃，每瓶放入4～5顆玻璃珠，在超凈臺(tái)上用移液管移取種子液體搖瓶菌種2 mL到搖瓶中，裝液量為400 mL。再放到搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為36 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 r/min。

1.2.4? 條件優(yōu)化

利用單因素試驗(yàn)法和正交試驗(yàn)法，以黃色短桿菌FY-18發(fā)酵產(chǎn)生的L-亮氨酸質(zhì)量濃度為優(yōu)化指標(biāo)，篩選最優(yōu)的培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件。

1.2.5? 分析和測(cè)定方法

（1）測(cè)定發(fā)酵液菌體濃度。取發(fā)酵液0.5 mL，加入9.5 mL 0.1 mol/L稀鹽酸中和碳酸鈣，混勻，在分光光度計(jì)620 nm波長(zhǎng)下用蒸餾水作空白進(jìn)行比色，比色結(jié)果記為A620 nm。發(fā)酵液中菌體濃度采用菌體溶液吸光度? ? ? ? A620 nm表示。（2）測(cè)定L-亮氨酸液相。處理發(fā)酵液后，用高效液相色譜法定量測(cè)定發(fā)酵液中游離的L-亮氨酸質(zhì)量濃度。（3）用生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵液的殘?zhí)恰?/p>

2?結(jié)果與分析

2.1? 單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化對(duì)發(fā)酵的主要影響

2.1.1? 單因素試驗(yàn)優(yōu)化對(duì)發(fā)酵的主要影響

不同碳源和氮源對(duì)L-亮氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵的影響如表1所示。

由表1可知，葡萄糖和硫酸銨是最合適的碳源和氮源。

2.1.2? 正交試驗(yàn)優(yōu)化對(duì)發(fā)酵的主要影響

對(duì)于通過(guò)生物發(fā)酵產(chǎn)生L-亮氨酸而言，種子培養(yǎng)基的主要功能是培養(yǎng)出更多的菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和含量對(duì)產(chǎn)物的合成速度和產(chǎn)量都有很重要的影響，所以有必要對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行更多的研究，通過(guò)生物制藥小試獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合理解與分析，選出最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。L-亮氨酸發(fā)酵種子培養(yǎng)基的主要成分有磷酸氫二鉀、葡萄糖、二次谷氨酸母液、硫酸銨、玉米漿干粉等。通過(guò)3個(gè)因素、4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（見(jiàn)表2）。

根據(jù)試驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)種子液中的菌體吸光度和發(fā)酵液中的L-亮氨酸質(zhì)量濃度分別進(jìn)行分析及計(jì)算，得到兩個(gè)優(yōu)選方案。對(duì)種子液中菌體吸光度的最優(yōu)方案是A2B2C3D3：對(duì)發(fā)酵液中L-亮氨酸質(zhì)量濃度的最優(yōu)方案是A2B2C3D2。以上兩個(gè)方案的數(shù)據(jù)基本一致，只有二次谷氨酸母液質(zhì)量分?jǐn)?shù)不一樣[10]。根據(jù)表2分析極差不難看出，以菌體吸光度為參考指標(biāo)時(shí)，雖然二次谷氨酸母液的極差排在第二，但是D2和D3的菌體量相差很少。因?yàn)樽罱K目的是得到更多的L-亮氨酸，所以最后選擇的最優(yōu)方案是A2B2C3D2。

2.2? 運(yùn)用單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化

利用單因素試驗(yàn)法，以黃色短桿菌FY-18發(fā)酵產(chǎn)生的L-亮氨酸質(zhì)量濃度為優(yōu)化指標(biāo)，篩選最優(yōu)的發(fā)酵條件。影響黃色短桿菌FY-18發(fā)酵產(chǎn)生的L-亮氨酸質(zhì)量濃度的因素為：溫度、pH、發(fā)酵液接種量、發(fā)酵液溶氧量，結(jié)果如表3～6所示。

溫度主要通過(guò)影響酶的活性來(lái)影響黃色短桿菌的產(chǎn)酸量，由表3可知，36 ℃時(shí)產(chǎn)生的L-亮氨酸最多。

pH主要通過(guò)影響酶的活性來(lái)影響黃色短桿菌的產(chǎn)酸量，由表4可知，pH為7.2時(shí)產(chǎn)生的L-亮氨酸最多。

接種量主要通過(guò)改變菌群的數(shù)量來(lái)影響產(chǎn)酸率，由表5可知，接種量為15%時(shí)產(chǎn)生的L-亮氨酸最多。

溶氧量主要通過(guò)改變菌群的數(shù)量來(lái)影響產(chǎn)酸率，由表6可知，溶氧量為20%時(shí)產(chǎn)生的L-亮氨酸最多。

3?結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)正交和單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，篩選出最適合黃色短桿菌FY-18生長(zhǎng)的培養(yǎng)基主要成分。最適合的成分為：葡萄糖∶硫酸銨=24.00∶6.00、玉米漿干粉12.00 g/L、磷酸氫二鉀0.60 g/L、二次谷氨酸母液10 mL/L。最佳培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)溫度36 ℃、pH為7.2、溶氧量為20%、接種量為15%。在最佳條件下，L-亮氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到24.68 g/L。

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