犬脂肪間充質干細胞的制備與初步應用

秦海斌 賀星亮 包喜軍 朱 騫 陳 舒

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，在一定條件下可以分化成為多種功能性細胞，其分類根據細胞發育階段可分為胚胎干細胞（ESC）和成體干細胞（ASC）；根據發育潛能可分為全能干細胞（如TSC）、多能干細胞（PSCs）和單能干細胞（如造血干細胞、神經干細胞等）。干細胞移植到患者體內后，具有各種組織和器官的修復、再生潛能，對神經、血液、心腦血管、肝臟、腎臟等多個系統的重大疾病具有明顯療效，正在成為各國政府、科技界和產業界的戰略必爭領域。

近幾年，犬的患病種類主要包括內科疾病、病毒性疾病、皮膚病、外科疾病、寄生蟲病、產科病和老年病等，其中內科疾病、病毒性疾病、皮膚病、外科疾病分別約占總發病數的38%、20%、18%和10%，而干細胞治療對上述疾病均有一定效果。因此，從技術上來看，干細胞治療在寵物犬、工作犬醫療領域具備廣闊的應用前景。但與醫學領域中的蓬勃發展形成鮮明對比，干細胞在寵物犬、工作犬中的研究和應用相對較少，尚未形成明顯的市場和社會效益。其原因包括干細胞研究的技術性較強、原材料不易獲取、法律法規尚未健全等諸多方面。犬類干細胞的制備、治療技術的研究和應用亟需開展。

本文以犬干細胞為研究對象，對干細胞的制備方法進行了初步的探索，并對干細胞制劑在皮膚損傷中的修復功能進行了實驗驗證，以期為工作犬的疾病防控提供一種有效的新技術、新產品。

一、材料與方法

實驗于2020年10月至2021年6月在警犬技術公安部重點實驗室、公安部南京警犬研究所實驗動物中心完成。犬的脂肪組織取自健康實驗用史賓格犬的皮下、腹腔，犬齡1～5歲；脂肪組織無菌采集后，放置于無菌平皿中密封運輸，在6小時內完成組織塊處理。

脂肪組織處理過程：酒精棉消毒平皿表面、側面后，在操作臺內打開平皿，取出脂肪塊，用含青霉素-鏈霉素雙抗的PBS沖洗3～5遍，去除肉眼可見的血管、血塊、紅細胞，剪碎至1cm3大小，等體積加入Ⅰ型膠原酶（濃度為0.075%），在37℃、200r/min的消化1h，加入等體積的 DMEM培養基(含10% FBS)終止消化，12000r/min離心10min， 去除上層液體、保留底部細胞沉淀，用5mL紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫靜置10min，1000r/min離心10min后去除上清液，用含15%FBS血清的DMEM培養基重懸底部細胞，以100目的銅網濾掉雜質后，移入培養皿行原代培養，每隔3天換液1次，直至細胞長成單層。

細胞傳代、凍存：原代細胞融合生長至80%以上表面積時，用體積分數為0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例進行傳代培養。取第3代、4代細胞，使用PBS沖洗3次后，體積分數0.25%胰蛋白酶消化，以體積分數含量為10%血清、10%DMSO的DMEM培養基作為凍存液，將細胞凍存于液氮。6個月后，復蘇細胞，觀察細胞的形態和生長特性。

細胞因子制備：在細胞傳代過程中，回收細胞生長速度快、細胞形態好、密度大的的細胞瓶內的細胞培養液，用0.22μm的濾膜過濾后分裝、凍存于-20℃，進行動物實驗、安全性評估、有效性評估。

動物實驗：本文主要針對1例動物的皮膚外傷，應用干細胞因子的進行治療實驗，觀察干細胞因子對修復皮膚損傷的和促進傷口愈合的功能，治療過程配合抗生素治療，防止化膿性感染。

二、結果

Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代脂肪間充質干細胞后，次日在平皿底部可見少量細胞貼壁，單個細胞呈現長梭形、星形、三角形等不規則形態、細胞大小不一；約3天后細胞數量逐漸增多，細胞縮短，呈梭型，形態和大小趨于均一；至第10天后細胞鋪滿單層，呈現一致的梭型形態，此時進行第1傳代；2代細胞6～7天可生長成單層細胞，在連續傳代過程中細胞形態、傳代速度基本保持不變；生長至7代、8代后生長速度減慢，至10天長成單層，9代、10代細胞分裂緩慢，約14天長成單層。第3代細胞凍存6個月后復蘇，細胞生長狀態良好，與正常細胞的生物學特征基本一致。

取第8代以前的細胞培養基混合液作為細胞因子，過濾后進行動物實驗，病例為外傷導致的后肢損傷，初期可見皮膚層附帶皮下肌肉層撕裂、脫落，趾骨暴露，每天用細胞因子噴霧3次，配合抗生素預防感染，噴霧后第3天可見皮下肌肉層明顯生長，皮膚創面減小，第12天創面基本愈合，只留小面積的皮膚結痂。噴霧法治療過程中未見過敏、炎癥、皮膚損傷等明顯損傷，初步判斷外用安全。

圖二：犬脂肪間充質干細胞生長因子治療皮膚損傷的效果觀察

三、討論

當前，工作犬領域干細胞治療制劑的缺乏，主要原因是因為干細胞來源、制備技術存在較高難度所致，在脂肪組織采樣、干細胞制備、治療方式等各個環節均存在許多技術難點，例如，在脂肪間充質干細胞制備過程中，通常采樣部位主要有腹腔內脂肪和皮下脂肪2個部位，均需進行外科手術，帶來一定的附加成本，而且犬因品種和體況不同，脂肪的堆積厚度存在很大差異，特別是對于長期訓練的工作犬而言，皮下脂肪層很薄、不易獲得，且樣本質量不高，干細胞儲存量較少，因此，本研究中主要采集內臟脂肪作為樣本，而且為了兼顧犬的福利制度，脂肪樣本一般在犬進行手術或者絕育時附帶采集，減少了犬的損傷，提高了樣本的質量；脂肪組織的培養，主要有組織塊培養法和Ⅰ型膠原酶消化法2種，以組織塊培養法獲取間充質干細胞時，需要對組織小塊進行微量培養基條件下的貼壁培養，此方法需要每天觀察、添加或更換少量培養基，操作次數和污染概率大大增加，且組織塊帶來的脂肪滴和組織碎片對細胞貼壁造成阻礙，不易形成單層細胞，本實驗中，改用Ⅰ型膠原酶消化法，雖然在組織處理階段比較煩瑣、獲取原代干細胞數量較少，但是后期的細胞貼壁、增殖效果更好，此方法適合于犬的間充質干細胞的小量制備；干細胞的治療方式包括細胞移植和干細胞因子2種，細胞移植主要應用于體內組織器官的再生和功能修復，干細胞因子則用于外傷、皮膚及其他局部炎癥的治療，本文中的案例為皮膚外傷，適合于探索干細胞因子的促生長功能，因此，本文中應用過濾后的干細胞培養基進行實驗，初步證明了干細胞因子安全，對犬的外傷具有切實的療效。

綜上所述，本文完成了干細胞制備、凍存、干細胞因子的分離純化等技術的實驗研究，并對干細胞制劑在皮膚損傷中的修復功能進行了初步驗證，為干細胞治療在工作犬中的深入研究和應用奠定了基礎。