超聲波輔助酶法提取紫薯花青素及抗氧化性研究

張瑩麗，鄧瑞瑞，李偉民

（許昌學院食品與藥學院，河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室，河南 許昌 461000）

紫薯又稱為紫甘薯、黑紅薯等，富含硒元素和花青素[1-2]，紫薯花青素是一類天然食用色素，是從紫薯中提取的花色苷類物質[3-4]，紫薯中含有的花青素比茄子、櫻桃等植物中所含的量要高[5-6]。紫薯花青素色澤艷麗，可用作著色劑；安全無毒，具備營養、藥理保健功效，也是一種天然的抗氧化劑[7]，在食品、醫藥等行業有著巨大的發展潛力[8]?；ㄇ嗨氐奶崛》椒ㄖ饕腥軇┨崛》╗9]、超聲波輔助提取法[10]、微波輔助提取法[11]、酶解法[12]、超臨界流體萃取法等[13]，單一的提取方法往往會存在一些不足，實際應用中常采用兩種或兩種以上的方法來提取，從而來提高花青素的提取率[14]。酶能專一性的分解大分子物質，超聲波可以破壞植物細胞壁，使其有效成分更易提取[8，13]。張慢等[13]對超聲波輔助酶法提取紫薯花青素進行了研究，結果表明提取效果比傳統方法有較大提高。徐穎等[8]研究證明超聲波輔助纖維素酶法能大大提高紫薯花青素的得率。本研究是在超聲波輔助的條件下，對雙酶法提取紫薯花青素的最佳工藝及紫薯花青素的抗氧化性進行研究，為紫薯花青素的提取提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：市售，干燥粉碎后過60目篩。原花青素標準品、α-淀粉酶（≥30 U/mg）、纖維素酶（≥10 000 U/g）：合肥博美生物科技有限公司；硫酸鐵銨、檸檬酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SYU-10-200DT超聲波清洗機：鄭州生元儀器有限公司；101-2電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機：湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；RE-52A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；JY052真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

用甲醇溶液將5 mg花青素標準品溶解定容到10 mL，制成標準液，濃度0.5 mg/mL。再將標準液稀釋定容，制成不同濃度梯度的標準系列使用液，然后將各濃度使用液分別移取1.0 mL與9.0 mL反應液[反應液為正丁醇∶濃鹽酸∶10%硫酸鐵銨=83∶6∶1（體積比）]在10 mL具塞試管內混勻，沸水浴40 min后冷卻，恢復室溫（25℃）后，以試劑空白調零，在波長520nm處測吸光值[13]。

1.3.2 紫薯花青素得率的計算

準確吸取1.0 mL定容后的紫薯浸提液于試管內，后續操作方法同1.3.1測定吸光值，然后根據標準曲線方程，由得率公式計算出紫薯花青素的得率[15]。

紫薯花青素得率/（mg/g）=c×v/m

式中：c為紫薯花青素的濃度，mg/mL；v為稀釋后的花青素溶液總體積，mL；m為樣品的質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 酶配比對紫薯花青素得率的影響

稱量 5 份紫薯粉，分別加入質量比為 0∶0、0∶6、6∶0、3∶3、2∶4、4∶2 的纖維素酶和 α-淀粉酶，酶總量為 6 mg/g，以料液比1∶20（g/mL）加入3.5%檸檬酸溶液，50℃下超聲20 min，其余操作步驟同1.3.1，根據標準曲線方程，由得率公式計算出不同酶配比提取的花青素得率，以此確定最佳酶配比。

1.3.3.2 料液比對紫薯花青素得率的影響

稱量5份紫薯粉，各加入6 mg/g質量比為1∶1的纖維素酶和α-淀粉酶，再分別以不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入 3.5%檸檬酸溶液，50℃下超聲提取20 min，冷卻后操作方法同1.3.1，然后根據標準曲線方程，由得率公式計算出不同料液比下花青素的得率，以確定最佳料液比[16]。

1.3.3.3 酶用量對紫薯花青素得率的影響

分別以酶用量 3、4、5、6、7 mg/g 加入質量比為 1∶1的纖維素酶與 α-淀粉酶，以料液比 1∶20（g/mL）加入3.5%檸檬酸溶液，50℃下超聲20 min，其余操作步驟同1.3.1，根據標準曲線方程，由得率公式計算出不同酶用量提取的花青素得率，以此確定最佳酶用量。

1.3.3.4 超聲提取時間對紫薯花青素得率的影響

固定加入的酶量為6 mg/g，料液比為1∶20（g/mL），50 ℃超聲溫度下分別提取 20、25、30、35、40 min，后續操作同1.3.1，根據標準曲線方程，由得率公式計算出不同超聲時間下提取的花青素得率，從而確定最佳超聲提取時間。

1.3.3.5 溫度對紫薯花青素得率的影響

固定加入的酶量為 6 mg/g，料液比 1∶20（g/mL），分別在 40、45、50、55、60℃的不同超聲溫度下提取 20min，后續操作同1.3.1，根據標準曲線方程，由得率公式計算出不同溫度下提取的花青素得率，從而確定最佳提取溫度。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗前提下，選用料液比、酶用量、超聲時間和提取溫度4個因素進行四因素三水平的正交試驗，從而來確定紫薯花青素提取工藝的最佳參數。

正交試驗因素水平表見表1。

表1 因素水平Table 1 Factor level

1.3.5 紫薯花青素的抗氧化活性試驗

紫薯花青素的·OH清除試驗[17]：先配制不同濃度梯度的紫薯花青素樣液，再在試管中分別依次加入1 mL 10 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液和各個濃度梯度下的花青素樣液，最后各自加入1 mL 8.8 mmol/LH2O2溶液，37℃水浴下反應0.5 h，以蒸餾水為空白對照，測定不同濃度的紫薯花青素樣液和抗壞血酸的吸光值，重復3次。·OH清除率計算公式如下。

·OH 清除率/%=（A0-A1）/A1× 100

式中：A0為空白吸光值；A1為樣品平均吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 酶配比對紫薯花青素得率的影響

不同配比的纖維素酶與α-淀粉酶對紫薯花青素提取得率的影響見圖1。

圖1 不同的酶比對紫薯花青素得率的影響Fig.1 Effect of different enzyme ratio on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖1可知，兩種酶質量比為3∶3時，紫薯花青素的得率明顯高于單一加入纖維素酶或者α-淀粉酶。說明纖維素酶與α-淀粉酶聯合作用下紫薯花青素的提取效果更顯著。纖維素酶能水解破壞構成植物細胞壁的纖維素成分，釋放細胞內的花青素等有效成分；α-淀粉酶能夠水解紫薯中豐富的淀粉，使得被包裹住的花青素釋放出來，從而達到分離提取紫薯花青素的目的。兩種酶聯合作用，能有效降解淀粉，破裂細胞壁，釋放細胞中的目標物質，使花青素的分離提取效果顯著[18]。

2.1.2 料液比對紫薯花青素得率的影響

不同料液比與花青素得率的關系見圖2。

圖2 料液比對紫薯花青素得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖 2 可知，花青素的得率從料液比 1∶10（g/mL）～1∶25（g/mL）漸漸升高，1∶25（g/mL）時得率最大，高于 1∶25（g/mL）時得率呈下降趨勢。該結果可能是由于在1∶25（g/mL）料液比下，提取劑幾乎可以浸提紫薯中溶出的全部花青素；再繼續增大提取劑的量，花青素含量也不會增多。所以，提取花青素的料液比以1∶25（g/mL）為最佳。

2.1.3 酶用量對紫薯花青素得率的影響

酶用量對紫薯花青素得率的影響見圖3。

圖3 酶用量對紫薯花青素得率的影響Fig.3 Effect of enzyme quantity on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖3可知，酶量從4 mg/g增加到5 mg/g時，紫薯花青素的得率有明顯上升趨勢，酶用量5 mg/g時得率最大；酶用量大于5 mg/g，得率又有所波動。由于底物紫薯粉是定量的，所以與之對應的有最適酶用量，能將紫薯粉徹底水解，使最終得到的有效物質含量最高。因此，提取花青素的酶添加量以5 mg/g為最佳。

2.1.4 超聲提取時間對紫薯花青素得率的影響

提取時間對紫薯花青素得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對紫薯花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖4可知，提取時間增長，得率隨之逐漸增大，時間為35 min時得率最高，時間超過35 min，得率開始下降。該結果的產生是因為酶作用于底物，反應需要一定的時間，35 min時酶促反應能夠充分進行，時間過長則酶促反應能力有所降低，以致最終得率有所下降。因此，提取紫薯花青素的超聲時間以35 min為最佳。

2.1.5 提取溫度對紫薯花青素得率的影響

溫度對紫薯花青素提取得率的影響見圖5。

圖5 溫度對紫薯花青素得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖5可知，溫度低于55℃時，得率隨溫度升高而增大，從40℃升高到45℃時，得率顯著增大，55℃時得率最高；溫度高于55℃時，得率有所下降。出現此種結果的原因是酶活隨溫度升高而增強，從而加快酶促反應速率，所以得率逐漸增大，直到溫度升高到該酶促反應的最適溫度55℃，此時花青素得率最高，溫度高于55℃，酶可能會失活或變性，而使得率降低。因此，提取紫薯花青素的溫度以55℃為最佳。

2.2 正交試驗結果分析

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2可知，紫薯花青素得率最高水平組合為A3B1C3D2，即料液比 1∶30（g/mL），酶用量 4 mg/g，超聲時間40 min，提取溫度55℃；由極差R值可看出影響紫薯花青素提取的主次因素為A（料液比）＞B（酶用量）＞D（提取溫度）＞C（超聲時間）。根據k值可知，A3B1C3D3為最優組合，其表示的水平條件為：料液比 1∶30（g/mL），酶用量4 mg/g，提取時間40 min，提取溫度60℃，此組合是通過計算得到的，稱為理論最佳水平組合。試驗最優水平組合和理論水平組合存在提取溫度上的差異。

2.3 驗證試驗

將試驗的最優水平組合A3B1C3D2與計算得到的理論最優組合A3B1C3D3進行驗證試驗。通過驗證試驗得出，A3B1C3D2組合下3次試驗得率的平均值為2.202 mg/g；A3B1C3D3組合下的3次試驗得率的平均值為2.154 mg/g。由此可確定提取紫薯花青素的最優水平組合為 A3B1C3D2，即料液比 1∶30（g/mL），酶用量4 mg/g，提取時間40 min，提取溫度55℃。

2.4 抗氧化試驗結果分析

紫薯花青素與抗壞血酸抗氧化能力比較見圖6。

圖6 紫薯花青素與抗壞血酸抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of antioxidant capacity between anthocyanin and ascorbic acid

由圖6可知，紫薯花青素具有較好的·OH清除能力，隨花青素濃度的增大清除·OH的能力逐漸增強，濃度增大到5mg/mL時，自由基的清除率將近100%；濃度低于0.5 mg/mL時，花青素與抗壞血酸（VC）抗氧化能力的差別逐漸增大；質量濃度增大，即大于0.5mg/mL時，兩者的羥自由基清除能力逐漸接近，逐漸接近100%。章萍萍[14]研究結果表明，紫薯花青素對·OH的清除率在低濃度時明顯低于VC，但隨著濃度的增加其清除能力隨之增大，當濃度達到8 mg/mL時，對·OH的清除能力和VC相近，達到90%以上，與本研究結果一致，說明紫薯花青素與VC對·OH的清除能力存在一定的量效關系。

3 結論

本文通過對紫薯花青素提取工藝和紫薯花青素抗氧化能力進行研究，得到如下結論：1）纖維素酶與α-淀粉酶聯合使用且質量比為1∶1時，花青素的提取得率最高。2）通過試驗得到紫薯花青素提取的最優條件為料液比 1∶30（g/mL）、酶用量 4 mg/g、提取時間40 min、提取溫度55℃。此條件下，紫薯花青素的得率最高。3）由羥自由基清除試驗中抗壞血酸與紫薯花青素的抗氧化能力比較可知，低于質量濃度0.5 mg/mL時，花青素與抗壞血酸的自由基清除率差異明顯，當濃度大于0.5 mg/mL，兩者的自由基清除率逐漸接近，差異逐漸變小，最終都達到最高值。