響應面法優化超聲輔助浸提葡萄籽原花青素

李瑞麗，張玎婕，趙琪，王惠妹，徐如彥

（1.鄭州輕工業大學煙草科學與工程學院，河南 鄭州 450001；2.江蘇中煙工業有限責任公司技術中心，江蘇 南京 210019）

原花青素（procyanidins，PC）是由兒茶素或表兒茶素縮合而成的生物類黃酮，作為天然強有效的自由基清除劑，能有效清除·OH、O2-·、NO·、DPPH·等多種自由基，具有舒張血管、降血糖、降血脂[1-3]，抑制腎、腸功能障礙、提高記憶力[4-6]，及抗肥胖、美白等作用[7-10]，尤其是原花青素的低聚體，其保健功能更是受到人們的廣泛關注[11-13]。

葡萄籽、松樹皮、蔓越桔等植物中PC含量豐富，自然界的PC多以氫鍵、疏水鍵與植物蛋白、多糖結合的形式存在，因此，從植物中提取PC多選用極性溶劑[11，14]。響應面優化設計可將因變量與多個自變量的二次函數關系用響應面直觀展示并確定最優條件或最優區域，是解決天然產物有效成分提取過程中多變量問題的有效統計方法[15-19]。

超聲波由于其空化效應、機械效應使得天然產物細胞壁破裂，有效成分可快速高效地溶出，在天然產物提取中具有耗時短、效率高等獨特優勢[20-24]。但其熱效應會導致體系局部過熱，對于熱敏性較差的目標產物有一定的破壞作用。因此，提出利用低頻短時超聲處理結合恒溫水浴的方法萃取葡萄籽中PC，縮短提取周期，提高提取效率，同時降低對目標產物的破壞性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：葡萄酒廠下腳料；兒茶素標準品、表兒茶素標準品（＞98%）：天津尖峰天然產物研究開發有限公司；香草醛、甲醇、濃鹽酸、無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Agilent1260Infinity型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；722G分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SB-3200DT超聲波萃取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市瑞利儀器設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

取適量葡萄籽，40℃電熱鼓風干燥箱中烘干（≥6.0 h），植物粉碎機粉碎，過40目篩，密封，備用。

1.3.2 葡萄籽原花青素提取

稱取一定量的葡萄籽粉末，加入適量一定濃度的乙醇溶液，室溫（20℃）下超聲輔助提取一定時間，然后恒溫熱回流浸提一定時間，離心處理取上清夜，即為葡萄籽PC提取液。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取時間對PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00g，加入70%乙醇溶液60mL，室溫（20℃）下超聲處理20 min，80℃恒溫水浴熱回流提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，測定葡萄籽 PC 提取率。

1.3.3.2 提取溫度對PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00g，加入70%乙醇溶液60mL，室溫（20 ℃）下超聲處理 20 min，分別在 50、60、70、80、90℃恒溫水浴中熱回流提取2.0 h，測定葡萄籽PC提取率。

1.3.3.3 乙醇濃度對PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00 g，加入乙醇溶液60 mL，室溫（20℃）下超聲處理20 min，80℃恒溫水浴中熱回流提取1.0 h，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，測定葡萄籽PC提取率。

1.3.3.4 液料比對PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00 g，分別添加70%乙醇溶液30、45、60、75、90 mL，室溫（20 ℃）下超聲處理 20 min，80℃恒溫水浴中熱回流提取1.0 h，測定葡萄籽PC提取率。

1.3.4 響應面優化試驗

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，提取時間、提取溫度、乙醇濃度、液料比各優選3個水平（見表1），采用四因素三水平響應面分析法優化PC提取條件。

表1 響應面優化因素水平Table 1 The factor level design of response surface optimization

1.3.5 原花青素分析方法

香草醛-鹽酸法測兒茶素、表兒茶素單體與原花青素總量：準確稱取兒茶素5.0 mg，去離子水溶解并定容至 25.0 mL，分別移取 1.0、2.5、4.0、5.5、7.0 mL 兒茶素標準溶液去離子水定容至10.0 mL，得濃度分別為20、50、80、110、140 μg/mL 兒茶素標準溶液。取兒茶素標準溶液1.0 mL，依次加入40 g/L香草醛-甲醇溶液6.0 mL，濃鹽酸3.0 mL，混合均勻，室溫（25℃）避光反應15.0 h。以香草醛-甲醇溶液∶濃鹽酸∶甲醇＝6∶3∶1（體積比）的混合溶液為空白對照，在500 nm處測吸光度。擬合溶液吸光度（y1）與單體及PC濃度（x1）標準曲線：y1=0.001 7 x1-0.041，R2=0.998 0。用于測定葡萄籽提取液中單體與原花青素總量的濃度。

式中：Y1為提取物中單體與原花青素總量，mg/g；v為提取液體積，mL；x為提取液濃度，μg/mL；n為提取液稀釋倍數；m為葡萄籽粉末質量，g。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測兒茶素、表兒茶素單體的量：準確稱取0.002 g兒茶素、0.002 g表兒茶素標準品于2 mL容量瓶，甲醇定容，然后依次稀釋分別得到500、100、50、20、10 μg/mL標準溶液，HPLC測定峰面積，擬合色譜峰面積對數（y2）與兒茶素濃度（x2）、表兒茶素濃度（x3）的標準曲線方程：兒茶素y2=1.037 7x2-1.086 5，R2=0.999 6；表兒茶素 y2=1.053 6x3-1.384 2，R2=0.999 3。用于測定提取液中兒茶素、表兒茶素單體濃度。

式中：Y2為提取物中兒茶素、表兒茶素單體量，mg/g；v為提取液體積，mL；x2為提取液兒茶素濃度，μg/mL；x3為提取液表兒茶素濃度，μg/mL；n 為提取液稀釋倍數；m為葡萄籽粉末質量，g。

1.4 數據處理

利用Excel2016、Origin 9.1進行單因素試驗數據處理和繪圖；利用Design-Expert 12.0軟件進行響應面試驗設計、響應曲面、等高線繪圖及回歸分析、方差分析和參數優化。

2 結果與分析

2.1 提取時間對PC提取率的影響

超聲波的機械作用、空化作用及熱效應是其加速天然產物有效成分提取的理論依據。空化作用、機械作用導致破壁使有效成分快速溶出，熱效應可使溶液內部溫度升高，利用超聲波破壁作用的同時避免局部溫度過高導致PC含量降低，采用超聲處理20 min，然后恒溫水浴熱回流浸提的方式提取，提取時間對PC提取率的影響見圖1。

圖1 提取時間對PC提取率的影響Fig.1 Influence of extraction time on the yield of PC

由圖1可知，提取時間小于1.5 h時，隨提取時間延長，葡萄籽PC提取率逐漸增加，但增幅逐漸減小，這是由于葡萄籽粉末與溶劑中PC的濃度差逐漸縮小所致。提取時間超過1.5 h后，PC提取率反而略降。提取時間1.0 h時，PC在葡萄籽粉末與溶劑中的傳質基本上達到動態平衡。

2.2 提取溫度對PC提取率的影響

提取溫度對PC提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對PC提取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on the yield of PC

由圖2可知，當提取溫度低于70℃時，葡萄籽PC提取率隨提取溫度增加呈增加趨勢，溫度升高利于傳質效率增加，可加快有效成分溶出速度，但雜質的溶出也會增加。同時，由于葡萄籽PC熱穩定性較差，高溫處理如90℃超過12 h或50℃超過24 h，葡萄籽提取物中PC含量明顯減少。提取溫度超過70℃后，PC提取率不升反降，90℃時反應液微有沸騰現象，PC提取率明顯下降。提取溫度為70℃時，PC的提取率相對最大。

2.3 乙醇濃度對PC提取率的影響

根據天然產物萃取中的相似相溶原理，乙醇溶液與PC極性越接近越利于PC從葡萄籽粉末溶出到乙醇溶液中。乙醇濃度對PC提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對PC提取率的影響Fig.3 Influence of ethanol volume on the yield of PC

由圖3可知，PC提取率隨濃度增加呈先增大后減小的趨勢，乙醇濃度為50%～60%時，PC提取率相對較大。

2.4 液料比對PC提取率的影響

液料比對PC提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對PC提取率的影響Fig.4 Influence of liquid-solid ratio on the yield of PC

溶劑用量與PC提取率呈正相關關系，由圖4可知，隨溶劑用量的增加，PC提取率逐漸增大，液料比達到15∶1（mL/g）時，PC提取率達到最大。溶劑用量再增大，對目標產物的提取率影響很小，負面作用是在增加溶劑成本的同時雜質溶出量增加不利于后續精制提純，因此液料比以 15∶1（mL/g）為宜。

2.5 響應面優化試驗

2.5.1 試驗方案及試驗結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，提取時間、提取溫度、乙醇濃度、液料比各優選3個水平，采用四因素三水平響應面分析法優化PC提取條件。響應曲面試驗設計方案及試驗結果見表2，其中，第25至29號試驗是各因素中心點組合的重復試驗，用于評估試驗誤差。

表2 響應曲面試驗設計方案及試驗結果Table 2 The experimental design and results of response surface analysis

續表2 響應曲面試驗設計方案及試驗結果Continue table 2 The experimental design and results of response surface analysis

2.5.2 回歸模型及方差分析

通過對響應面優化試驗結果數據進行多元回歸分析，建立PC提取率與提取時間、提取溫度、乙醇濃度、液料比這4個因素的回歸模型。PC提取率回歸方程：Y=-5.23+2.98X1+0.17X2+0.02X3+0.27X4+0.004X1X2-0.01X1X3-0.03X1X4+0.000 4X2X3-0.000 6X2X4+0.000 1 X3X4-0.95X12-0.000 1X22-0.000 4X32+0.009X42。

回歸模型方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA results of quadratic model

由表3可知，顯著性檢驗中，回歸模型P＜0.000 1，失擬項P=0.174 3，即回歸模型極顯著而失擬不顯著，說明PC提取率與各因素的回歸模型有統計學意義，而且沒有其它對PC提取率影響顯著的因素被忽略。R2和調整R2均在0.95以上，模型擬合度較好且有良好的預測性，可在模型基礎上進行結果分析和方案優化，明確超聲輔助提取葡萄籽PC的最優工藝。

PC提取率與各因素的回歸模型中，X1、X2的一次項和二次項的P值均小于0.000 1；X4的一次項的P值小于0.001，二次項的P值小于0.000 1；X3的一次項的P值遠大于0.05，二次項的P值小于0.01；說明提取時間、提取溫度是影響葡萄籽PC提取率的主要因素，液料比次之，乙醇濃度對葡萄籽PC提取率的影響相對較小。提取時間與乙醇濃度、提取時間與液料比、乙醇濃度與液料比的交互作用對葡萄籽PC提取率有顯著影響。其它因素間的一級交互作用P值均大于0.05，對PC提取率無顯著影響。

2.5.3 響應曲面分析

各因素交互作用響應曲面圖及其在底面的投影（即等高線圖）見圖5。

圖5 各因素交互作用響應曲面圖和等高線圖Fig.5 The interaction effect and contour on extraction rate of PC between two factors

由圖5可知，隨提取時間延長、提取溫度升高，葡萄籽PC提取率均呈逐漸增大的趨勢，到達因素中心值以后，提取率隨時間延長、溫度升高反而減小，提取溫度升高導致的PC提取率下降更為明顯。隨乙醇濃度、液料比增大，PC提取率基本均呈逐漸增加的趨勢。對比響應曲面圖的陡緩趨勢，提取時間對提取率的影響較大，其次是提取溫度，再次是液料比，而乙醇濃度響應曲面相對平緩，說明乙醇濃度對提取率的影響相對較小。對比各因素交互作用的等高線圖，提取時間與乙醇濃度、提取時間與液料比的交互作用影響較大，等高線為橢圓形，其次是提取溫度與乙醇濃度、乙醇濃度與液料比的交互作用，等高線為近似橢圓形；而提取時間與提取溫度、提取溫度與液料比的交互作用影響較小，等高線近似圓形。這與回歸模型方差分析的結果一致，利用響應面優化設計可明確提取時間、提取溫度、乙醇濃度和液料比等因素對葡萄籽PC提取率的影響。

在研究范圍內，響應面分析回歸模型預測葡萄籽PC提取率最高的工藝條件為室溫（20℃）下超聲處理20 min后，水浴熱回流提取時間1.15 h，提取溫度67.78℃，乙醇濃度 50.06%，液料比 15.92∶1（mL/g），回歸模型預測此條件下的PC提取率為4.713%。其次為室溫（20℃）下超聲處理20 min后，水浴熱回流提取時間1.0 h，提取溫度70℃，乙醇濃度60%，液料比15∶1（mL/g），回歸模型預測此條件下的PC提取率可達4.710%。兩種工藝條件下PC提取率相差很小，僅為0.003%，兼顧試驗條件實際操作，確定最優工藝條件為室溫（20℃）下超聲處理20 min后，水浴熱回流提取時間1.0 h，提取溫度70℃，乙醇濃度60%，液料比15∶1（mL/g）。最優工藝條件下重復3次試驗，葡萄籽PC提取率為4.68%，與模型預測值4.71%接近，RSD為1.22%。說明響應面優化工藝可重復性較好，工藝可靠。

3 結論

超聲輔助結合恒溫水浴萃取葡萄籽PC的過程中，提取時間對葡萄籽PC提取率的影響較大，其它依次是提取溫度、液料比，乙醇濃度對提取率的影響相對較小。響應面優化的最佳工藝條件為室溫（20℃）下超聲處理20 min，水浴熱回流提取時間1.0 h，提取溫度 70℃，乙醇濃度 60%，液料比 15∶1（mL/g）。在此條件下3次驗證試驗，PC提取率均值為4.68%，與模型預測值4.71%接近，RSD為1.22%。該提取工藝設備要求不高，且工藝有良好的重現性和可操作性。PC作為天然的抗氧化劑，應用前景和開發潛力較大。下一步工作考慮分離PC低聚物單體，研究其抗氧化活性，探索PC低聚體中對抗氧化活性貢獻較大的主要單體。