支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號通路活化程度的關系研究

劉紅紅，邢寧寧，師麗敏，李愛軍

(河北省邢臺市第三醫院呼吸科，河北 邢臺 054000)

支氣管哮喘是由炎癥細胞介導的呼吸系統疾病，以氣道慢性炎癥、平滑肌紊亂以及氣道重塑為主要特征，其中氣道重塑是誘發患者發生氣道高反應性的重要因素，可引發肺心病、阻塞性肺氣腫等疾病[1]。嗜酸粒細胞(eosinnophil,EOS)是引發支氣管哮喘的重要炎癥細胞，氣道受到過敏原刺激可激活機體免疫系統，誘導EOS分泌大量的炎性介質(如多種白細胞介素、趨化因子)，進而導致支氣管黏膜損傷、功能障礙等[2-3]。戴紹文等[4]通過實驗證實EOS參與支氣管哮喘的發生發展，EOS的細胞功能活性與氣道炎癥因子分泌密切關聯。磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(phosphatidylinositol kinase 3/Protein Kinase B,PI3K/Akt)信號通路在調控機體免疫、炎癥反應方面發揮重要作用，該通路的激活可誘導EOS的生長、增殖、遷移等生物學過程，特別是促進EOS的定向遷移[5]。聚集到氣道的EOS通過產生活性氧而介導蛋白質和脂質、DNA的異常生理功能，加劇了支氣管高反應性、炎癥反應[6]。目前關于支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號通路的關系尚未明確，因此，本研究將通過分析臨床樣本進行論證，旨在探討EOS與支氣管哮喘患者氣道炎癥的相關機制，從而指導新藥開發。現報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2017年10月—2020年4月于我院就診的36例氣管哮喘患者作為觀察組，選取同時段于我院的36例健康體檢者為對照組。觀察組納入標準：①符合中華醫學會呼吸病學會制定的哮喘防治指南中的診斷標準[7]；②臨床表現：肺部可聞及哮鳴音，咳嗽、胸悶、發作性喘息；③病歷資料完整 。排除標準：①治療前1個月內接受支氣管擴張劑、白三烯受體阻滯劑、糖皮質激素治療；②心、肝、腎等重要臟器功能障礙；③重癥哮喘、感染和過敏性疾病；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤精神意識障礙。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 基線資料比較Table 1 Comparison of baseline information (n=36)

本研究經醫院倫理委員會批準通過。

1.2方法

1.2.1病例資料收集 回顧分析所有患者病歷資料，包括性別、年齡、體重指數、吸煙史、呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)體積濃度、血清總IgE水平、氣道重塑指標等信息，并對此次研究的病歷資料保密性負責。氣道重塑指：氣道壁面積占氣道總橫截面積百分比(WA%)=[π(D/2)2-π(L/2)2]/π(D/2)2×100%，支氣管管壁厚度與外徑比(T/D)，T=(D-L)/2，L、D分別為氣道內、外徑。患者入組后均接受高分辨胸部CT掃描，選取中動脈弓和氣管分叉下1 cm、氣管分叉處上1 cm、右肺下靜脈和橫隔頂上 2 cm 處，采用電子標尺測量L、D以及T，均連續測量3次取均值。

1.2.2誘導痰細胞分布 患者吸入沙丁胺醇，10 min后用清水漱口以及高滲鹽水超聲霧化，深咳嗽并將痰液放置于培養皿中，收集密度大、黏稠度高的痰液，稱重后加入二硫蘇糖醇裂解，濾去雜質，離心后PBS懸浮，采用臺盼蘭鑒定細胞活力。制作細胞涂片，多聚甲醛固定，染色、烘干、封片，光學顯微鏡下進行細胞(中性粒細胞、巨噬細胞、EOS)分類。

1.2.3PI3K/Akt信號通路蛋白表達檢測 采用Westblot印跡法檢測蛋白表達水平。收集誘導痰后，采用梯度離心法分離多形核白細胞。誘導痰在Ficoll-PaquePLUS淋巴分離液(芬蘭GE Healthcare)中分層，于室溫1 000 g離心30 min，通過EOS、紅細胞的低滲溶解分離多形核白細胞，并使用EOS分離試劑盒(美國MiltenyiBiotek)分離EOS。細胞液裂解分離后的EOS后，加入總蛋白提取液，轉入1.5 mL EP管中，10 000 r/min離心10 min，采用Bradford方法測定總蛋白濃度，將蛋白質量濃度稀釋為5 mg/L。取20 μL蛋白液，變性后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，隨后轉膜，加入兔抗人Akt、p-Akt、PI3K、β-actin一抗(1∶500)，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，采用化學底物發光法顯色。采用Image-Qua NT軟件測量顯色條帶的光密度，計算各組蛋白相對β-actin的表達量。

1.3統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，采用Pearson分析EOS與各指標的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組誘導痰細胞分布情況 2組誘導痰中的細胞分布情況差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組EOS占比均明顯高于對照組，而中性粒細胞、巨噬細胞占比明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組、對照組誘導痰細胞分布情況比較Table 2 Comparison of distribution of induced sputum cells in observation group and control group

2.2EOS與氣道重塑指標、氣道炎癥標志物的關系 以觀察組患者EOS的均值為臨界值，將觀察組患者分為高EOS組和低EOS組，2組患者的FeNO體積濃度、血清總IgE、T/D、WA差異有統計學意義，其中高EOS組的FeNO體積濃度、血清總IgE、T/D、WA明顯高于低EOS組(P<0.05)，見表3。

表3 EOS與氣道重塑指標、氣道炎癥標志物的關系Table 3 Relationship between eosinophils and airway remodeling and airway inflammation markers

2.3EOS與PI3K/Akt信號通路的關系 高EOS組和低EOS組的PI3K、p-Akt表達水平差異有統計學意義，其中高EOS組患者的PI3K、p-Akt表達水平明顯高于低EOS組(P<0.05)，見表4，圖1。

圖1 PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達情況

表4 EOS與PI3K/Akt信號通路的關系Table 4 Relationship between eosinophils and PI3K/Akt signaling pathways

2.4氣道炎癥標志物與PI3K/Akt信號通路的關系 Pearson分析顯示FeNO體積濃度、血清總IgE分別與PI3K、p-Akt具有正相關性(P<0.05)，見表5，圖2～5。

表5 氣道炎癥標志物與PI3K/Akt信號通路的關系Table 5 Relationship between airway inflammatory markers and PI3K/Akt signaling pathways

圖2 FeNO與p-Akt的關系

圖3 FeNO與PI3K的關系

圖4 血清總IgE與p-Akt的關系

圖5 血清總IgE與PI3K的關系

3 討 論

支氣管哮喘以反復發作的咳嗽咳痰、胸悶氣喘等為主要臨床癥狀，反復發作可損傷氣道內皮細胞，并誘導平滑肌細胞、細胞外基質過度增殖，引起氣道狹窄，以及加重氣道高反應性和氣流受限，最終危及患者生命安全[8]。哮喘的發生涉及EOS、T細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞，其中以EOS最具特征性，臨床研究發現隨著慢性持續期患者病情的加重，誘導痰EOS呈增加趨勢，表明EOS與哮喘病情嚴重程度存在相關性，通過開展誘導痰細胞學檢查可客觀反映炎癥、氣道狀態，以及早期評估病情變化[9]。EOS來源于骨髓CD34+祖細胞，參與多種炎癥疾病的發生發展，如在過敏性鼻炎中EOS通過分泌嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、酸性粒細胞過氧化物、主要堿性蛋白、嗜酸性粒細胞神經毒素等顆粒蛋白而參與炎癥反應，如誘導炎性細胞的黏附聚集、刺激炎性因子的分泌等[10]。EOS的血管內皮遷移涉及滾動、牢固黏附、跨內皮遷移等過程，主要由黏附分子、趨化因子、細胞因子間的網絡調控細胞進行調節，其中PI3K/Akt信號通路可誘導炎癥細胞以及炎癥介質的形成和釋放，從而引發氣道變應性疾病(支氣管哮喘、過敏性鼻炎等)[11]。研究發現抑制PI3K/Akt信號通路后，EOS的脫顆粒蛋白、增殖、遷移等過程受到抑制，表明PI3K/Akt信號通路在調控EOS的生物學功能方面發揮重要作用[12]。

本研究結果顯示，觀察組、對照組誘導痰中的細胞分布(EOS、中性粒細胞、巨噬細胞)差異有統計學意義(P<0.05)，其中觀察組患者EOS占比明顯高于對照組，與既往研究結果一致[13]，表明支氣管哮喘患者中氣道炎癥表型以EOS為主，占比高達50%，可通過痰液中EOS的計數評估氣道炎癥和區分炎癥表型。EOS在過敏性氣道炎癥過程中的趨化性可反映炎癥進程，如過敏原激發試驗顯示支氣管哮喘患者血液中EOS對化學物質具有更強的反應性，誘導物可增強EOS的趨化性，并刺激釋放毒性顆粒蛋白，引起氣道組織活性氧損傷[14]。FeNO、血清總IgE均是氣道炎癥標志物[13]，其中FeNO可評估患者哮喘炎癥程度和疾病控制水平，以及反映肺功能狀態，IgE是機體受到免疫原刺激后產生的特異性免疫球蛋白，可增加EOS、肥大細胞的敏感性，刺激炎癥因子分泌，從而加重支氣管哮喘的氣道炎癥反應。本研究表明觀察組患者的氣道炎癥標志物(FeNO體積濃度、血清總IgE)水平差異有統計學意義(P<0.05)，且進一步分析發現隨著EOS比例增加，血清總IgE、FeNO體積濃度呈增加趨勢，表明EOS比例與炎癥標志物存在相關性。另外，觀察組患者的T/D、WA均明顯高于對照組，與蔣凌志等[15]研究結果一致，氣道重塑是引起支氣管哮喘持續惡化的病理基礎，可導致肺纖維化和肺功能降低。高EOS組的T/D、WA均明顯高于低EOS組，分析認為EOS誘導的氣道炎癥反應可損傷氣道內皮組織，刺激平滑肌細胞、杯狀細胞的增生，降低氣道痙攣可逆性，進而增加氣道高反應性及氣流受限程度，故而導致氣道重塑。

PI3K/Akt 信號通路可調控多種免疫細胞(EOS、肥大細胞、T 淋巴細胞等)的分化、活化，進而參與氣道變應性疾病的病理生理過程。本研究顯示，高EOS組的PI3K、p-Akt表達水平明顯高于低EOS組，進一步證實PI3K/Akt信號通路的活化與EOS的增殖、遷移密切關聯。包海鵬等[16]研究發現PI3K/AKT 信號通路通過調節下游p-Akt的表達而調節EOS的生物學過程，EOS通過Eotaxin(可刺激EOS的趨化性)處理可激活PI3K/Akt 途徑，促進EOS的增殖、遷移和脫顆粒蛋白的表達，進而誘發氣道炎癥反應。同時本次研究通過Person相關性分析顯示FeNO體積濃度、血清總IgE與PI3K、p-Akt具有正相關性，進一步證實支氣管哮喘患者氣道炎癥與EOS的PI3K/Akt信號通路活化程度具有相關性。Huang等[17]研究發現哮喘患者氣道周圍浸潤著大量的炎癥細胞，阻斷PI3K/Akt信號通路后可阻斷炎癥細胞浸潤，降低炎癥因子的表達(纖維連接蛋白1、I型膠原等)，以及增加黏鈣蛋白的表達，從而阻斷上皮間質轉化，進而減輕哮喘患者氣道重塑過程。PI3K信號通路還可以通過刺激氣道平滑肌細胞的增殖以及調控氣道平滑肌細胞的生長周期而加重支氣管哮喘氣道炎癥反應，另外，哮喘動物模型實驗以及支氣管哮喘患者的臨床觀察均能發現PI3K信號通路的異常活化，且通過PI3K抑制劑處理后可明顯抑制支氣管哮喘的發生發展，進一步表明PI3K/Akt信號通路與支氣管哮喘的炎癥、氣道重塑等病理過程密切關聯。

綜上所述，支氣管哮喘患者的EOS的PI3K/Akt信號通路處于活化狀態，與氣道炎癥(FeNO、血清IgE)具有正相關性。