17β-雌二醇及補(bǔ)骨脂素對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用

王振濤 劉金釗

摘要 目的：觀察17β-雌二醇對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。方法：將大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）暴露于不同濃度的17β-雌二醇、補(bǔ)骨脂素增殖和成骨分化培養(yǎng)基。通過茜素紅（Alizarin Red）染色法觀察細(xì)胞增殖;通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）和實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）評估成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原的分泌水平以及關(guān)鍵因子RUNX2的表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組比較，17β-雌二醇補(bǔ)充劑促進(jìn)BMSCs增殖。BMSCs增殖添加的17β-雌二醇的不同劑量（0、0.001、0.01、0.1 nmol/L），有效地改善了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原的水平，RUNX2的mRNA也被上調(diào)。17β-雌二醇干預(yù)后第5天，Ⅰ型膠原表達(dá)顯著升高（P<0.05），在17β-雌二醇干預(yù)的第7天，RUNX2 mRNA及蛋白表達(dá)隨17β-雌二醇水平的增加而升高（P<0.05）。結(jié)論：17β-雌二醇聯(lián)合補(bǔ)骨脂素可以作為一種有效的調(diào)節(jié)劑，以提高骨髓再生中MSC的能力。

關(guān)鍵詞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;17β-雌二醇;補(bǔ)骨脂素;成骨細(xì)胞;成骨相關(guān)基因RUNX2;細(xì)胞分化;誘導(dǎo)作用;Ⅰ型膠原

Abstract Objective：To observe the inducing effects of 17β-estradiol on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts.Methods：BMSCs from rat bone marrow were exposed to different concentrations of 17 beta-estradiol（E2） and psoralen proliferation and osteogenic differentiation media.Cell proliferation was observed by Alizarin Red staining，and the secretion of collagen type I and the expression of key factor RUNX2 were evaluated by ELISA and real-time PCR.Results：17 β-estradiol supplements promoted the proliferation of BMSCs compared with the control group.The different doses of 17 β-estradiol（0，0.001，0.01，0.1 nmol/L） added to the proliferation of BMSCs effectively improved the level of type I collagen secreted by bone marrow mesenchymal stem cells，and the mRNA of RUNX2 was also up-regulated.On the 5th after β-estradiol intervention，the expression of type I collagen was significantly increased（P<0.05）.On the 7th day of 17β-estradiol intervention，RUNX2 factor mRNA and protein expression increased with the increase of 17 β-estradiol concentration（P<0.05）.Conclusion：17 beta-estradiol combined with psoralen can be used as an effective regulator to improve the ability of MSCs in bone marrow regeneration.

Keywords Bone marrow mesenchymal stem cells; 17 beta estradiol; Psoralen; Osteoblast; Osteogenic related gene RUNX2; Cell differentiation; Induction; Type I Collagen

中圖分類號：R512.91文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.010

基于成體干細(xì)胞的骨組織工程現(xiàn)已成為臨床治療由創(chuàng)傷、腫瘤切除和先天性無效引起的骨骼缺損的有前景的替代方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）被認(rèn)為是這種方法的潛在細(xì)胞來源，因?yàn)樗哂凶晕腋潞投嘀胤只哪芰ΑＨ欢軌蚩煞蛛x的骨髓BMSCs的數(shù)量非常小，并且對于骨再生的臨床應(yīng)用是不充分的[1-3]。已經(jīng)證明包括年齡、骨質(zhì)疏松癥和關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的各種病理生理因素可進(jìn)一步降低細(xì)胞數(shù)量及其增殖和分化能力。最近有報道稱，老年捐贈者骨髓中的BMSCs數(shù)量明顯低于年輕捐贈者。老年捐贈者的BMSCs衰老百分比及其復(fù)制時間顯著增加。雖然理論上BMSCs數(shù)量可以通過體外細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，但由于細(xì)胞衰老，操作會導(dǎo)致增殖和分化潛能顯著降低。因此，BMSCs增殖和成骨分化的有效改善對于基于BMSCs的骨再生的臨床應(yīng)用是必需的。類固醇激素積極參與骨代謝并且在包括BMSCs的許多類型的細(xì)胞中具有多功能調(diào)節(jié)作用。例如，糖皮質(zhì)激素在BMSCs的多重分化中起關(guān)鍵作用，并上調(diào)成骨、軟骨形成和脂肪形成分化潛能。在骨質(zhì)疏松癥研究中，發(fā)現(xiàn)雌激素不僅可以預(yù)防骨吸收，還可以通過募集成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞來增加骨形成[4-5]。最近的一項(xiàng)研究表明，補(bǔ)充17β-雌二醇可有效刺激人和小鼠BMSCs的增殖能力。17β-雌二醇還具有提高間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）分化潛能的強(qiáng)大能力，包括成骨和成脂分化。17β-雌二醇通過雌激素受體作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。最近的研究表明雌激素水平的變化是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一個重要原因[6]。此外，其他研究發(fā)現(xiàn)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度，改善骨質(zhì)疏松癥癥狀。“腎主骨生髓”理論與BMSCs成骨分化有關(guān)。《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“腎主骨髓，在體為骨。”《素問·宣明五氣》曰：“腎生骨髓，其充在腎。”因此，本研究通過四唑類化合物[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-t etrazolium，MTS]測定法測量細(xì)胞增殖，研究17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素對大鼠BMSCs增殖和分化的影響及其對大鼠BMSCs分泌Ⅰ型膠原的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇清潔級3月齡SD大鼠12只，雌雄各半，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，批號：20190302。許可證號：SCXK-（軍）2020-003，動物實(shí)驗(yàn)倫理審批號：20200356，動物飼養(yǎng)條件：環(huán)境溫度為22 ℃左右，濕度設(shè)置為40%～60%，光照周期為12 h，保持正常自由飲食。

1.1.2 藥物 1%抗生素-抗真菌劑（青霉素+鏈霉素），醫(yī)院自配，青霉素（瑞陽制藥有限公司，批號：019005），鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號：018043），地塞米松（瑞陽制藥有限公司，批號：020013），β-甘油磷酸（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，批號：019237）。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（上海素爾生物科技有限公司，貨號：10437-028），17β-雌二醇（艾美捷科技有限公司，貨號：10006315-10），補(bǔ)骨脂素（成都格利普生物科技有限公司，貨號：66-97-7），TRIzol試劑（北京柏萊斯特科技公司，貨號：LGTZ001），Dulbecco′s改良培養(yǎng)基（Dulbecco′s Modified Eagle Medium，LG-DMEM），培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技公司，貨號：PM150210C）。電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-20H），聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）儀（賽默飛世爾科技公司，美國，型號：NEW VeritiPro）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 12只清潔級SD大鼠通過CO2吸入實(shí)施安樂死。無菌條件下取其來自脛骨和股骨的骨髓，用不含17β-雌二醇等類固醇的培養(yǎng)基沖洗骨髓腔以洗脫髓腔內(nèi)細(xì)胞。以上所述培養(yǎng)基由不含酚紅的α-MEM培養(yǎng)基、10%活性炭剝離的胎牛血清和1%抗生素-抗真菌劑（青霉素+鏈霉素）組成。將細(xì)胞以5×107個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)皿接種，并在37 ℃，5% CO2中與不含17β-雌二醇等類固醇的培養(yǎng)基一起溫育。在第3天，通過培養(yǎng)基更換去除未附著的細(xì)胞來分離MSC。將MSC孵育至80%的濃度，然后以106個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)皿的密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。檢測細(xì)胞CD44、CD90、CD105均呈陽性表達(dá)，而CD34、CD45呈陰性表達(dá)，鑒定為BMSCs。使用雄性和雌性大鼠的第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Passage-1 Bone Mesenchymal Stem Cells，Passage-1 BMSCs）研究17β-雌二醇對BMSCs增殖的功能。將1 000個傳代的BMSCs細(xì)胞放入96孔板的每個孔中，分為4組，每組250個，分別暴露于補(bǔ)充不同劑量的無類固醇培養(yǎng)基（0.001、0.01、0.1 nmol/L）的17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素。分別記作對照組、0.1 nmol/L 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組、0.01 nmol/L17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組及0.001 nmol/L 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組。

1.2.2 干預(yù)方法 對照組不進(jìn)行藥物干預(yù)處理，而對0.1 nmol/L 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組、0.01 nmol/L 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組及0.001 nmol/L 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組分別給予對應(yīng)劑量的17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理，在第7天，使用茜素紅S染色法（Alizarin Red Staining）觀察細(xì)胞增殖，所有步驟均按照說明書嚴(yán)格操作。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1）實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）測定Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related Transcriptional Factor 2，RUNX2） mRNA表達(dá)：實(shí)時PCR用于量化細(xì)胞因子RUNX2的基因在誘導(dǎo)3、5、7 d后的表達(dá)情況。使用總RNA提取試劑（TRIzol）試劑從BMSCs提取總RNA，并使用純化PCR產(chǎn)物法（QIAquick PCR Purication Kit）純化。用DNAse I使用第一鏈cDNA合成試劑盒和隨機(jī)六聚體引物逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。使用熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green PCR Master Mix）進(jìn)行定量實(shí)時PCR。選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。RUNX2、GAPDH基因引物序列見表1。反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 35 s，35個循環(huán)（95 ℃ 35 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 35 s），72 ℃延伸10 min。計算Ct值，得到反應(yīng)的擴(kuò)增曲線，計算不同誘導(dǎo)天數(shù)BMSCs中細(xì)胞因子RUNX2 mRNA相對表達(dá)量，產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。2）BMSCs細(xì)胞中Ⅰ型膠原的水平與RUNX2蛋白的測定：將傳代-1雄性和雌性大鼠BMSCs以105個細(xì)胞/100 mm培養(yǎng)皿的密度接種。在70%的濃度下，將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充有不同濃度17β-雌二醇（0.001、0.01、0.1 nmol/L）的成骨分化培養(yǎng)基。成骨分化培養(yǎng)基由補(bǔ)充有100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸和0.05 mmol/L的Dulbecco改良培養(yǎng)基（LG-DMEM）組成。成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)3、5、7 d后，收集各組上清液，根據(jù)說明書，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試劑盒測量大鼠BMSCs分泌Ⅰ型膠原的水平。蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測RUNX2蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用單因素方差分析進(jìn)行樣本間比較，測量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠BMSCs的培養(yǎng)、誘導(dǎo)與形態(tài)觀察 將大鼠BMSCs接種培養(yǎng)48 h后換液，可觀察到單核細(xì)胞多以圓形形態(tài)生長，有的細(xì)胞呈長梭形，似成纖維細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較多。見圖1A。使用含有0.001 nmol/L 17β-雌二醇的誘導(dǎo)后可見多個散在分布的、大小形態(tài)不均一的棕色鈣化結(jié)節(jié)。見圖1B。

2.2 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素對大鼠BMSCs分泌Ⅰ型膠原的影響 與對照組比較，第3天時，17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素不同劑量處理組對大鼠BMSCs分泌Ⅰ型膠原影響的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;第5天時，Ⅰ型膠原分泌量較對照組顯著提高，不同劑量17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素處理組較對照組均正相關(guān)（P<0.05）;在第5天和第7天時，17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素對Ⅰ型膠原的分泌具有劑量依賴性。見表3。

2.3 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素對大鼠BMSCs RUNX2因子蛋白表達(dá)的影響 誘導(dǎo)第7天時，RUNX2蛋白表達(dá)升高。見圖2～3。

2.4 17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素對大鼠BMSCs RUNX2 mRNA表達(dá)的影響 BMSCs增殖添加的17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素的不同劑量（0、0.001、0.01、0.1 nmol/L），有效地改善了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原的水平，RUNX2的mRNA也被上調(diào)。17β-雌二醇干預(yù)后第5天，Ⅰ型膠原表達(dá)顯著升高（P<0.05），干預(yù)第7天，RUNX2 mRNA及蛋白表達(dá)隨17β-雌二醇劑量的增加而升高（P<0.05）。見圖4～5。

3 討論

限制骨髓MSC作為骨組織工程有希望的細(xì)胞來源的障礙是有限的細(xì)胞供應(yīng)和降低的分化潛能。MSC增殖和分化的有效改善在確定基于MSC的骨再生的成功臨床應(yīng)用中起關(guān)鍵作用。最近已經(jīng)證明類固醇可以增加MSC的增殖和分化，并延緩衰老[7-9]。本研究表明，17β-雌二醇促進(jìn)MSC增殖和成骨分化。17β-雌二醇顯著改善了成骨分化期間成骨生長因子的合成。這些數(shù)據(jù)有力地表明17β-雌二醇可能作為有效的調(diào)節(jié)劑起作用，以提高M(jìn)SC再生骨髓的能力。此外，本研究首次證明了17β-雌二醇調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的性別差異。類固醇的最佳劑量和改善MSC增殖和成骨潛力的相互作用，有效地根據(jù)MSC供體的性別而變化。17β-雌二醇受體，成骨標(biāo)志物和細(xì)胞因子之間的關(guān)系也是性別依賴性的。這些結(jié)果為將來改善和優(yōu)化MSC成功骨再生能力提供了重要信息;但是，該機(jī)制需要進(jìn)一步研究。最近在成人干細(xì)胞研究文獻(xiàn)中已經(jīng)注意到干細(xì)胞的性別差異[10-14]。有研究發(fā)現(xiàn)從雌性小鼠分離的肌源性干細(xì)胞（Muscle-derived Stem Cells，MDSCs）比從雄性小鼠分離的MDSCs具有更高的骨骼肌再生效率[15]。從雄性小鼠分離的MDSCs具有比從雌性小鼠分離的MDSCs更強(qiáng)的成骨潛能和骨再生[16-17]。還發(fā)現(xiàn)從雄性分離的人脂肪來源的干細(xì)胞比從雌性分離的那些更具成骨性[18]。雖然這種機(jī)制很少被討論，但其中一個可能的因素是17β-雌二醇受體的性別差異，這些受體在干細(xì)胞增殖和分化中起關(guān)鍵作用。

目前的研究表明，17β-雌二醇對MSC具有很強(qiáng)的促有絲分裂作用[19-20]。17β-雌二醇的作用是雙相的，并且17β-雌二醇在高劑量下失去功能甚至抑制細(xì)胞增殖。發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇對雌性大鼠MSC具有更多的促有絲分裂功能，而雌激素和地塞米松的組合對雄性大鼠MSC具有更多的促有絲分裂功能。低水平的雌激素和地塞米松對雄性大鼠MSC增殖具有協(xié)同作用。同樣，在地塞米松存在下，雌二醇的補(bǔ)充有效地改善了MSC的成骨分化;然而，最大限度地上調(diào)成骨標(biāo)志物的劑量具有性別差異。較低劑量的17β-雌二醇上調(diào)ALP峰值活性，這是雌性MSC成骨分化的早期標(biāo)志，而不是雄性。然而，與雌性MSC比較，成熟的成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨鈣素（Osteocalcin，OCN）的峰值出現(xiàn)在雄性MSC的17β-雌二醇劑量較低的情況下。在雄性和雌性中產(chǎn)生峰值OCN量的17β-雌二醇劑量與BMP-7表達(dá)的水平一致。后者與雄性和雌性大鼠MSC中的類固醇受體高度相關(guān)。因此，我們認(rèn)為MSC在成骨分化期間與17β-雌二醇補(bǔ)充的性別差異可能是由類固醇受體的變化引起的。本研究中多種類固醇受體之間的關(guān)系也顯示了雄性和雌性MSC之間的差異。這也表明類固醇受體的差異可能是成骨分化中性別二態(tài)性的原因。

類固醇激素在細(xì)胞和組織代謝中相互作用。糖皮質(zhì)激素和雌激素已經(jīng)被證明可以交互作用于它們的受體并調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞。據(jù)報道雌二醇（E2）在成骨分化期間增加雌激素受體α（Estrogen Receptor α，ERα），而在雌性小鼠MSC中不增加ERα[21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇補(bǔ)充劑不僅可以上調(diào)ERα，還可以上調(diào)雄性和雌性供體的MSC的糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid Receptor，GR）和雄激素受體（Androgen Receptor，AR）。E2還上調(diào)雄性供體的MSC的ERα，而對雌性MSC的作用較少。ERα的變異與雄性和雌性MSC中的ER，GR和AR水平高度相關(guān)。ER與雄性MSC中的GR和AR相關(guān)，與雌性MSC中的GR無關(guān)。這表明雌激素受體β（Estrogen Receptor β，ERβ）可能在用E2補(bǔ)充劑處理的雄性和雌性MSC的成骨分化中起不同作用。

據(jù)報道，雌激素可通過上調(diào)成骨生長因子的數(shù)量來增加骨髓細(xì)胞的成骨分化，包括骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）-2，BMP-6和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming Growth Factor-beta 1，TGF-β1）[22]。本研究表明，17β-雌二醇補(bǔ)充劑可有效上調(diào)雄性和雌性MSC中TGF-β1的表達(dá)。上調(diào)的TGF-β1與MSC的堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）高度相關(guān)。此外，首次探索E2在MSC的成骨分化過程中有效上調(diào)BMP-7的作用。BMP-7已被廣泛認(rèn)為是骨再生的成骨蛋白。BMP-7的功能包括骨形成和癌細(xì)胞增殖，是產(chǎn)生雌激素依賴的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中，BMP-7的mRNA被17β-雌二醇補(bǔ)充劑上調(diào)，并且在成骨分化期間與雄性和雌性大鼠MSC中的類固醇受體高度相關(guān)。這表明E2增加成骨分化的機(jī)制之一可能是通過上調(diào)BMP-7。骨碎補(bǔ)能有效地促進(jìn)BMSCs增殖和骨向分化，上調(diào)TGF-β1、BMP-2的表達(dá)量可能是其作用機(jī)制之一，并由此影響其在骨髓中的增殖和分化，使干細(xì)胞具有遷移歸巢的特性。雖然目前使用的成骨標(biāo)志物包括ALP和OCN肯定會影響MSC的成骨潛能，但它們不是MSC骨形成能力的可靠預(yù)測因子。因此，需要在體外和體內(nèi)定量測量MSC的骨形成，以進(jìn)一步證實(shí)MSC的類固醇調(diào)節(jié)功能。

本研究初步揭示了成骨分化過程中成骨細(xì)胞和類固醇受體相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性。然而，未來使用基因敲除技術(shù)和開展拮抗劑的研究對于進(jìn)一步證明這一點(diǎn)是必要的。17β-雌二醇和補(bǔ)骨脂素具有促進(jìn)MSC增殖和分化的作用，并且RUNX2參與了該調(diào)控過程。

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（2019-02-14收稿 責(zé)任編輯：王明）