原發性免疫性血小板減少癥患者骨髓TPO及c?mpl水平測定意義

黃菊 衛仿仙 韓艷霞 沈閃華 王宙政

1上海市公共衛生臨床中心，復旦大學附屬公共衛生臨床中心（上海201508）；2嘉興學院附屬第二醫院，嘉興市第二醫院（浙江嘉興314000）

原發性免疫性血小板減少癥（primary immune thromb ocytopenia，ITP）既往稱之為特發性血小板減少性紫癜，是一種獲得性孤立性血小板減少為特征的自身免疫性出血性疾病，約占成人出血性疾病的1/3。部分患者在診斷時可能無癥狀，也可能出現輕微的皮膚黏膜出血，有5%患者可能出現嚴重出血，甚至危及生命［1］。到目前為止ITP 診斷仍然是一種排他性診斷，其發病率在2 ～ 4 例/10萬，有2 個發病高峰期，一個在20 ～ 30 歲之間，女性多發，另一個發病高峰期在60 歲左右，男女比例相當［2-3］。ITP 發病機制及病理生理仍然復雜，既往觀點一致認為ITP 患者體內存在體液免疫異常，對自身血小板抗原免疫失耐受，患者體內產生針對血小板的自身抗體，血小板和自身抗體結合后在網狀內皮系統被巨噬細胞吞噬，從而引起外周血血小板水平降低。但近年來更多證據表明ITP 不僅存在體液免疫異常，同時還存在細胞免疫功能異常，體液免疫和細胞免疫異常活化，共同介導血小板破壞加速及巨核細胞產生血小板不足。臨床治療手段很多，但療效仍不確切，不同患者的治療反應也不一樣。并且不同治療手段所帶來的副反應以及給患者帶來的經濟負擔，都是臨床醫生在作出治療選擇前所面臨的挑戰，目前尚缺乏一系列行之有效的預后判斷因素，能夠更為精準地選擇治療方案。本研究通過檢測50 例ITP 患者及20 例脾功能亢進癥患者和16 例骨髓增生異常綜合征（MDS）患者骨髓TPO 及其受體c?mpl 的水平，分析其在ITP 的診斷與鑒別診斷中的意義，同時通過不同治療組中TPO 及c?mpl 表達水平情況判斷在治療反應評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取我科2016年1月至2018年12月收治的50 例ITP 患者，其中女30 例（PLT ≥30 × 109/L 者12 例，< 30 × 109/L 者18 例），男20 例（PLT ≥30×109/L者8例，<30×109/L者12例），年齡15 ～ 89 歲，平均（43.32 ± 16.28）歲；其中PLT ≥30 × 109/L 組年齡（45.83 ± 2.45）歲，< 30 × 109/L組年齡（40.75±1.63）歲，根據血常規、骨髓細胞學等確診，并完善抗核抗體、ANCA、血沉、免疫球蛋白、淋巴結彩超、胸腹部CT 等檢查排除其他疾病所致繼發性血小板減少，所有患者均根據出血評分系統進行出血評分［1］，收集初始治療時血小板計數、骨髓巨核細胞總數、產板巨核細胞數、產巨比。選取同期住院脾功能亢進癥患者20 例，其中男10 例，女10 例，年齡43 ～ 83 歲，平均（61.8 ± 10.05）歲。選取同期入院經骨髓細胞學檢查確診為MDS 患者16 例，其中男7 例，女9 例，年齡15～90 歲，平均（53.87 ± 21.86）歲。所有病例的診斷均依據2014年中華醫學會血液學分會制定的《骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國專家共識》確診［4］。研究對象基本資料見表1。

表1 研究對象基本資料Tab.1 Basic information of research object ±s

表1 研究對象基本資料Tab.1 Basic information of research object ±s

組別ITP 組MDS 組脾功能亢進組例數50 16 20性別（例）男20 7 10女30 9 10年齡（歲）43.32±16.28 53.87±21.86 61.80±10.05 PLT 基數（×109/L）24.08±21.74 23.13±13.96 32.25±14.46

1.2 樣本采集及處理 所有患者在第一次入院時均進行血常規、骨髓細胞學及免疫球蛋白、淋巴細胞亞群檢測，同時計數血小板水平、骨髓巨核細胞總數、產板巨核細胞數、產巨比（產板巨核細胞/巨核細胞總數），分別留取骨髓液2 管，每管1 mL，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，利用紅細胞裂解液裂解成熟紅細胞，運用流式細胞儀進行c?mpl檢測，實驗管加入鼠抗人APC?TPOR（CD110）、Per?CP?CD34、FITC?CD41、PE?CD61單克隆抗體各20 μL；陰性對照管中分別加入APC?鼠IgG1、PerCP?鼠IgG2、FITC?鼠IgG1、PE?鼠IgG2 各20 μL，均孵育30 min 后加入溶血素，避光溶血8 min，離心棄上清后用PBS 洗滌2 次，應用流式細胞儀（BD FACS Calibar，美國BD 公司）檢測，每管記錄細胞數均大于1 × 109/L。另一管進行離心分離出上清，液氮罐中保存，以留作TPO 濃度檢測，采用雙抗體夾心酶聯免疫法（TPO ABC?ELISA 法檢測試劑盒，為Merck 公司產品，Bio?Tek ELx?800 酶標儀），以抗人TPO 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的TPO 與單抗結合，加入生物素化的抗人TPO，形成免疫復合物連接至酶標板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin 與生物素結合，加入酶底物OPD，出現黃色后加終止液硫酸顏色變深，在492 nm 處測OD值，TPO 濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中TPO 濃度。

1.3 治療方案及療效判定標準 遵照ITP 診治指南，所有首次入院ITP 患者均進入ITP 治療路徑，根據PLT 水平選擇治療方案，如PLTT ≥30×109/L選擇臨床觀察治療，如PLT < 30 × 109/L 則選用一線治療方案，根據血小板水平、出血評分及患者經濟條件，決定是否聯合促血小板生成藥物（IL?11針、特比奧針）或丙種球蛋白針。在本次研究中共有12 例患者僅用糖皮質激素［地塞米松針按照潑尼松1.0 mg/（kg·d）等效劑量靜脈滴注］，11 例患者在地塞米松針治療基礎上加用了特比奧針或（和）IL?11 針，另有7 例患者三者聯合治療（糖皮質激素+促血小板生成藥物+丙種球蛋白針）。定期檢測血小板，療效評判標準遵照成人原發性免疫性血小板減少癥中國專家共識：（1）完全反應（CR）：治療后PLT ≥100×109/L 且沒有出血。（2）有效（R）：治療后PLT≥30×109/L 并且至少比基礎血小板計數增加兩倍，且沒有出血。（3）無效（NR）：治療后PLT< 30 × 109/L 或者血小板計數增加不到基礎值的兩倍或者有出血。（4）復發：獲得CR 或R 后，血小板計數再次<30×109/L 或有出血。定義CR 或R 時，應至少檢測2 次，期間至少間隔7 d［1］。初期反應時間是指從開始用藥到血小板恢復到≥30 ×109/L 或至少比基礎血小板計數增加兩倍，且沒有出血情況的檢測時間。

1.4 隨訪 所有ITP 患者均在出院后進行門診及電話隨訪，總隨訪時間1年。其治療及觀察療程在3 ～ 12 個月之內。根據隨訪結果提供的血小板計數和臨床出血情況評估患者疾病轉歸，并根據患者隨訪緩解情況進行分組，將病例分為治療有效組（CR+R）共18 例，治療無效/復發組（NR）共12例，其中1 聯治療方案有效7 例，無效5 例；2 聯方案有效7 例，無效4 例；3 聯方案有效4 例，無效3 例。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關分析定量資料采用Pearson 相關分析，等級資料采用Spearman 相關分析，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TPO 濃度及其受體c?mpl 表達水平測定ITP 組總巨核細胞、產板巨核細胞均較MDS 組和脾功能亢進癥組要高，但產巨比更低，差異均有統計學意義（P< 0.05），而TPO 和c?mpl 表達水平卻比其他兩組低，差異也均有統計學意義（P< 0.05）。見表2。

表2 三組間各觀察指標統計Tab.2 The observation index statistics among the three groups ±s

表2 三組間各觀察指標統計Tab.2 The observation index statistics among the three groups ±s

注：&ITP 組與脾功能亢進癥組比較，P<0.05；*ITP 組與MDS 組比較，P<0.05；#MDS 組與脾功能亢進癥組比較，P<0.05

組別ITP MDS脾功能亢進& t 值P 值* t 值P 值# t 值P 值年齡（歲）43.32±16.28&53.87±21.86 61.80±10.05&-4.718<0.001-1.78 0.09 1.445 0.158 PLT 基數（×109/L）24.08±21.74 23.13±13.96 32.25±14.46-1.546 0.127 0.165 0.870 1.918 0.064總巨核細胞(個）405.64±131.83&*117.88±55.16*#202.15±92.91.239<0.001 8.462<0.001 3.38 0.002產板巨核細胞（個）122.98±43.24*52.18±24.06*#100.2±51.98#1.734 0.093 6.225<0.001 3.407 0.002產巨比（%）0.31±0.06*&0.45±0.08 0.49±0.12&-8.08<0.001-6.055<0.001 1.287 0.207 TPO 濃度（ng/mL）175.93±25.59*&221.89±43.56*#197.76±24.08&#-3.365 0.002-5.201<0.001-2.111 0.042 c?mpl 表達（%）1.07±0.29*&1.49±0.38*1.37±0.41&-3.34 0.001?4.525<0.001-0.925 0.362

2.2 不同血小板水平的ITP 患者TPO 及c?mpl 表達 PLT < 30 × 109/L ITP 患者TPO、c?mpl 表達水平高于PLT ≥30 × 109/L ITP 患者組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 不同血小板水平的ITP 患者TPO 及c?mpl 表達情況Tab.3 The expression of TPO and c?mpl in ITP patients with different platelet levels ±s

表3 不同血小板水平的ITP 患者TPO 及c?mpl 表達情況Tab.3 The expression of TPO and c?mpl in ITP patients with different platelet levels ±s

注：*兩組比較差異有統計學意義，P<0.05

組別PLT<30×109/L PLT ≥30×109/L t 值P 值例數30 20性別（男/女）12/18 8/12年齡（歲）43.86±17.35 42.5±14.91 0.297 0.768巨核總（個）408.5±129.59 401.35±138.4 0.184 0.855產板巨（個）119.63±44.41 128.0±42.04-0.674 0.504產巨比0.29±0.06 0.32±0.06-1.949 0.058 TPO（ng/mL）182.65±20.71*165.84±29.26 2.224 0.033 c?mpl（%）1.17±0.24*0.92±0.32 2.973 0.005

2.3 不同治療反應組相關因素分析 PLT<30×109/L ITP 患者中治療有效組治療反應時間比無效組短，產巨比比無效組低，出血評分比無效組高，差異均有統計學意義（P< 0.05），見表4。相關性分析結果顯示，出血評分與療效成正相關，反應時間產巨比與療效成負相關（P<0.05），見表5。

表4 不同治療反應組相關因素分析Tab.4 Analysis of related factors in different treatment response groups±s

表4 不同治療反應組相關因素分析Tab.4 Analysis of related factors in different treatment response groups±s

注：*兩組比較差異有統計學意義，P<0.05

組別有效組無效組t 值P 值例數18 12出血評分2.91±1.75*1.98±1.51 1.885 0.038病程（d）2.12±2.08 2.67±2.19-0.535 0.597 PLT 基數（×109/L）7.44±6.11 8.58±6.13-0.499 0.622反應時間6.01±2.35*8.18±3.75-2.621 0.001巨核總（個）415.33±132.83 398.25±129.67 0.35 0.729產板巨（個）118.55±44.58 126.25±46.07-0.159 0.875產巨比0.28±0.04*0.33±0.92-1.159 0.007 TPO（ng/mL）182.99±17.09 182.14±26.06 0.099 0.933 c?mpl（%）1.13±0.15 1.23±0.34-1.134 0.266

表5 療效影響因素相關性分析Tab.5 Correlation analysis of influencing factors of curative effect

3 討論

本研究發現，ITP 組與脾功能亢進癥組在發病年齡上存在差異，ITP 組相對年輕，而脾功能亢進癥患者發病年齡相對高，這與脾功能亢進癥多繼發于肝硬化、門脈高壓癥等疾病，并且多呈一個相對緩慢的發展過程、逐漸出現失代償有關，而與MDS 組相比二者無差異。在發病時血小板計數水平上三者之間差異均無統計學意義。在骨髓產生巨核細胞功能上看，三者之間差異均有統計學意義。其中ITP 患者巨核細胞總數相對更高，脾功能亢進癥患者居中，而MDS 患者巨核細胞總數相對最少，提示ITP 患者存在骨髓巨核系代償性增生，但產板巨核細胞相對較低，與MDS 組相比差異有統計學意義。ITP 組產巨比（產板巨核細胞/總巨核細胞）與脾功能亢進癥組和MDS 組比較差異均有統計學意義，提示ITP 患者存在巨核系發育成熟障礙，產巨比也可以作為ITP 與其他血小板減少性疾病的鑒別診斷要點之一，但具體產巨比臨界值需要進一步探討。

在TPO 濃度上，三者之間比較差異均有統計學意義，MDS 患者TPO 濃度水平最高，脾功能亢進癥者次之；而在其受體表達水平上，MDS 受體表達水平更高，ITP 表達水平最低，兩者之間比較差異有統計學意義，脾功能亢進癥組表達水平居中，與ITP 組比較差異有統計學意義，但與MDS 組相比差異無統計學意義。

在PLT<30×109/L 組和PLT ≥30×109/L 組二者之間發病年齡上差異無統計學意義，在出血評分方面差異有統計學意義，且發病時間上前者發病時間急，病程短，多1 天至數天，且出血更嚴重，多伴有輕微或嚴重出血，而PLT ≥30×109/L 組中，血小板水平相對更高，而在PLT<30×109/L 組中，血小板多呈比較低的狀態，出血評分與血小板水平呈負相關關系（r=-0.778，P<0.05）。但二者在巨核細胞總數、產板巨核細胞及產巨比三方面來比較差異均無統計學意義。在TPO 表達水平上，PLT < 30 × 109/L 組中TPO 濃度比PLT ≥30 × 109/L組TPO 濃度更高，且與血小板水平呈負相關關系（r=-0.369，P<0.05），但相關性不強。同樣，在c?mpl 表達水平上，PLT < 30 × 109/L 組中c?mpl 表達更高，而PLT ≥30×109/L 組中表達相對更低，與血小板水平呈負相關關系（r=-0.474，P< 0.05），但與TPO 水平呈正相關關系（r= 0.707，P< 0.05）。在相關性分析中發現出血評分和發病時間是影響治療方案選擇的主要因素，但治療方案對療效無直接影響。通過對ITP 不同治療反應患者對比研究發現，早期反應時間、出血評分、產巨比在治療有效組和無效組之間差異有統計學意義，提示這些指標可能對預后評估有較大影響，反應時間越短、產巨比越低、出血評分越高達到緩解幾率越大，也許對預后有著一定預測意義。對上述指標進行相關性分析發現出血評分與預后呈正相關關系（r= 0.401），反應時間與預后呈負相關關系（r=-0.534），產巨比與預后呈負相關關系（r=-0.373），但相關性不強，尚需積累更多的實驗數據來證實。

ITP 是血液科非常常見的一種疾病，可表現為出血、疲勞乏力，血常規中主要表現為單一血小板減少、白細胞及紅細胞水平正常，部分出血嚴重者可伴有貧血，盡管沒有證據表明出血嚴重程度與患者血小板水平之間的關聯程度，但一般認為PLT ≥50×109/L 時發生出血風險相對較少，而PLT<30×109/L時極易發生出血［5］。到目前為止，ITP 尚沒有確診實驗依據，依然是排他性診斷，那么能否從常規實驗檢查中尋求一些對ITP 的診斷有確診意義的分子標志物顯得非常重要。

血小板生長發育過程中需要許多細胞因子參與作用，隨著人們認識的深入，發現其中最為重要的有：血小板生成素（thrombopoietin，TPO），它是巨核細胞增殖、成熟和血小板產生過程中的主要調控因子，作用非常廣泛，涉及到造血細胞增殖、分化和成熟的全過程，通過與其受體結合而發揮上述調控功能［6-7］。TPO 基因定位于染色體3q27，全長6.2 kb，由7個外顯子和6個內含子組成，肝臟、腎臟、肌肉及骨髓中都含有豐富的TPO mRNA，其表達水平受血小板數量反饋調節。血小板生成素受體c?MPL 基因定位于1p34，全長9 kb，由12 個外顯子和11 個內含子組成，在造血干細胞、巨核前體細胞、血小板表面都有表達，二者通過多種信號傳導途徑發揮作用。通過與TPO 結合，促進巨核細胞和造血干/祖細胞增殖分化，發育至成熟血小板，另一方面又能通過血小板上的TPO 結合位點，清除并使TPO 代謝，從而維持血小板造血平衡［8-9］。本研究發現ITP 患者多伴有內源性TPO 不足，同時c?mpl 表達水平也相對不足。而脾功能亢進癥及MDS 患者骨髓TPO 和c?mpl 表達水平均比ITP 組高，在三者中MDS 表達水平最高，SEIKI 等［10］發現MDS 患者TPO 水平升高，并且在不同的組別中顯示出差異，高TPO 水平多提示MDS 低危、預后良好。MDS 病例數相對較少，未對MDS 患者進行危險度分層，只是與ITP 患者進行了比較。從這點上來看，TPO 和C?MPL 水平可以作為ITP 與其他血小板減少相關性疾病的鑒別診斷依據，但需要進一步擴大樣本量以找出作為鑒別意義的界定值范圍。這也為ITP 患者進行TPO 及其受體激動劑治療提供了實驗依據。但由于進行治療的患者數有限，尚未能明確ITP 患者骨髓TPO 及c?mpl 水平對療效是否有影響，尚需要進一步加大樣本量。

既往的研究中認為TPO 可以使其受體c?mpl mRNA 表達下調（down?regulation），這種作用具有劑量依賴性［11］，外加的rhTPO 越高，c?mpl mRNA 表達越低，TPO 降低，情況則相反，它反映了細胞因子調節的多樣性，即TPO 不存在轉錄水平的負反饋調節，但能夠通過對受體c?mpl mRNA 的下調來實現對自身功能的調節。另一方面，血小板和巨核細胞的數量可通過反饋機制調控TPO 的基因表達，從而維持機體巨核系發育、血小板生成的動態平衡［12］。但本研究發現，ITP 患者的骨髓TPO 和c?mpl 表達水平并沒有因為血小板水平低下而反饋性升高，也提示ITP 患者的發生可能與體內TPO及c?mpl 水平相對不足有關。但將ITP 患者組按血小板水平來進一步分為PLT < 30 × 109/L 和PLT ≥30 × 109/L 組發現，二者在TPO 水平、c?mpl 表達水平上還是存在差異的，PLT < 30 × 109/L 組中TPO和c?mpl 表達水平要高，因此表明ITP 患者體內依然存在一定的反饋調節作用，但因為本研究涉及病例數有限，反饋調節作用并不明顯，后期可以考慮進一步加大樣本量、優化分組檢測。

在絕大多數ITP 患者中骨髓絕大多數均增生活躍，巨核系統增生活躍，巨核細胞總數也明顯增加［13］，近年來有研究表明在ITP 的發病過程中巨核系的凋亡發揮了很大作用，DENG 等［12］通過檢測凋亡標志物發現ITP 患者中促凋亡分子（如Bak 和Bax）增強，而抗凋亡分子（如Bcl?xL）的表達明顯減弱，提示血小板凋亡增強；VON 等［14］證實程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）途徑在巨核細胞譜系的發育成熟中起著獨特的作用。由于遺傳或環境因素的干擾，使得這些嚴格調控的途徑出現紊亂、不平衡，最終導致血小板生成減少。因此認為PCD 失調與ITP 中的外周血血小板破壞，髓內細胞凋亡和無效的血小板生成有關。在本研究中發現ITP 患者骨髓巨核細胞總數較脾功能亢進者及MDS 患者均要高，但產板巨核細胞卻比較低，與前述觀點一致。總之巨核系的發育成熟障礙在ITP 的發生發展中起著至關重要的作用［15］。通過抑制巨核系凋亡，誘導巨核細胞發育分化，也許是未來ITP 治療研究方向。

目前ITP 的治療手段非常多，其中一線治療主要包括糖皮質激素及靜脈注射用丙種球蛋白針，臨床比較常用的二線治療如IL?11、促血小板生成素（TPO 制劑），但每種治療手段都有其優劣性，療效并不確切［16］，約有60% ～ 70%成人患者需要選擇其他二線治療，包括脾臟切除、TPO 受體激動劑、其他免疫抑制劑等，對于不同的患者有明顯的個體差異性［1］，僅對于糖皮質激素而言在用藥劑量、用藥療程以及藥物種類的選擇等方面，在臨床仍存在諸多爭議［17］，如何避免嚴重不良反應，獲得最好治療效果、性價比相對更高的治療手段，目前仍不清楚。在精準治療時代如何對ITP 患者選擇更為精準的手段來治療，是目前非常重要的研究內容。盡管部分患者在發作一次后即能達到立即緩解，也有70%患者可以在診斷很長一段時間后出現自然緩解或治療后緩解，還有30%患者會出現復發［2］。在臨床治療過程中，治療方案的選擇多取決于起病的急緩、病程的長短、出血評分，但ITP 患者最終治療效果與治療方案選擇并沒有必然的聯系，而鑒于治療方案的潛在副作用、給患者帶來的相應經濟負擔，實際上臨床醫生迫切需要一種行之有效的可以預測影響療效的相關因素，從而在選擇治療方案時才能做到有的放矢。但在本研究中發現治療有效組和治療無效組在治療前出血評分、治療反應時間、產巨比三方面差異有統計學意義，與療效之間有一定相關性，但相關性并不強，總巨核細胞、TPO 濃度及c?mpl 表達水平與療效無明顯相關性，同時考慮到本研究樣本量少，需要加大樣本量進一步明確。

總之，ITP 的發病機制目前尚未完全明了，無確診實驗依據，需排他性診斷，TPO 濃度、c?mpl 表達水平及產巨比降低均有助于ITP 的診斷，但需要進一步明確參考值范圍。出血評分、治療反應時間和產巨比對預后有一定的預測價值，但也需要進一步加大樣本量檢測其可靠性，也值得進一步深入研究。巨核系凋亡及血小板程序性死亡值得進一步探討，抑制巨核系凋亡、誘導發育分化也許將成為未來ITP 治療新選擇。