全反式維甲酸通過調控sFlt?1表達對滋養(yǎng)層細胞侵襲及促血管形成能力的影響

陽雙健 鐘黎黎 盛瑩 郭江虹 何宜靜

1南華大學衡陽醫(yī)學院，附屬第一醫(yī)院產科（湖南衡陽421001）；2南華大學衡陽醫(yī)學院，附屬第二醫(yī)院婦產科（湖南衡陽421001）

子癇前期（PE）屬于妊娠期特有疾病，指孕婦在懷孕20 周以后出現(xiàn)以高血壓、蛋白尿為主要臨床表現(xiàn)的一組臨床綜合征［1］。既往研究顯示［2?3］，胎盤生長因子（PIGF）和血管內皮細胞生長因子（VEGF）含量在子癇前期患者的胎盤組織及血清中降低，而可溶性血管內皮生長因子受體1（sFlt?1）含量升高，表明胎盤血管發(fā)育異常與子癇前期形成有關。全反式維甲酸（ATRA）是維生素A 的生物活性衍生物，在體內和體外均表現(xiàn)出調節(jié)細胞分化、增殖和凋亡的作用［4?5］。有研究［6］指出，ATRA 在子癇前期患者子宮脫膜組織中低表達，胎盤中ATRA 異常表達可能影響到滋養(yǎng)細胞的浸潤過程，但ATRA 在此過程中是否參與胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲、遷移等過程的調控以及具體機制尚未明確。因此，本研究擬初步探討ATRA 對滋養(yǎng)細胞sFlt?1 表達的影響以及ATRA 通過調控sFlt?1 表達對滋養(yǎng)細胞侵襲及促血管形成能力產生影響，以期為ATRA 治療子癇前期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人胎盤滋養(yǎng)細胞系HTR?8/SVneo 購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；ATRA 購自美國Sigma 公司；sFlt?1、基質金屬蛋白酶?2（MMP?2）、基質金屬蛋白酶?9（MMP?9）和GAPDH 抗體均購自美國Abcam 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Hy?Clone 公司；反轉錄試劑盒、實時定量PCR 試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；sFlt?1 過表達質粒構建及慢病毒包裝、濃縮及純化由漢恒生物科技（上海）公司完成；PIGF、sFlt?1 和VEGF ELISA 試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HTR?8/SVneo 細胞復蘇后培養(yǎng)于含1%青霉素?鏈霉素溶液和5%胎牛血清的RP?MI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代。

1.2.2 ATRA 干預后細胞中sFlt?1 表達檢測 取對數(shù)生長期HTR?8/SVneo 細胞，按照1 × 106個/mL的細胞數(shù)接種于6 孔板，待細胞生長至60%融合度時，采用0.15 μmol/L ATRA 分別處理細胞0、12、24、48、72 h，然后采用qRT?PCR 和ELISA 法分別檢測細胞中sFlt?1 mRNA 表達水平及蛋白含量。

1.2.3 細胞感染及分組處理 待細胞生長至60%融合度時，分別取陰性對照慢病毒（Vector）和sFlt?1 過表達質粒慢病毒（Lv?sFlt?1）感染HTR?8/SVneo細胞（感染比例為1∶50），另設未經病毒感染的細胞作為空白對照組（blank），分別記為Lv?sFlt?1 組、Vector 組和blank 組。感染8 h 后吸除原培養(yǎng)基，更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h 后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達株，分別采用RT?PCR 和Western blot實驗驗證sFlt?1 過表達效果。而后將細胞分為4組：（1）對照組（Control）：HTR?8/SVneo 細胞不經任何處理；（2）ATRA 組：HTR?8/SVneo 細胞經0.15 μmol/L ATRA 處理24 h；（3）Lv?sFlt?1 組：穩(wěn)定過表達sFlt?1 的HTR?8/SVneo 細胞不經任何處理；（4）ATRA+Lv?sFlt?1 組：穩(wěn)定過表達sFlt?1 的HTR?8/SVneo 細胞經0.15 μmol/L ATRA 處理24 h。

1.2.4 qRT?PCR 檢測細胞中sFlt?1 mRNA 表達水平 收集細胞，采用Trizol 法取總RNA，通過紫外分光光度計檢測總RNA 的含量及純度，按照逆轉錄試劑盒合成cDNA，逆轉錄產物作為下一步PCR模版，sFlt?1 上游引物序列5′?GCAC CTTGGTTGTG?GCTGACT?3′，sFlt?1 下游引物序列5′?GGGC CC?GGGGGTCTCA TTATT?3；GAPDH 上游引物序列5′?ACTAG GCGCTCACTGTTCTC?3′，下游引物序列5′?AT CCGTTGACTCCGACCTTC?3′。按照試劑盒說明書進行操作，4 倍梯度稀釋模板cDNA 制作標準曲線，確認各個基因的擴增效率，確定cDNA 上樣濃度。根據反應條件在每個循環(huán)延伸末端收集熒光信號，繪制擴增曲線。PCR 擴增儀按照95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸20 s的條件擴增40 次。采用2?△△Ct法計算sFlt?1 mRNA相對表達量。

1.2.5 ELISA 檢測細胞上清中sFlt?1、PIGF 和VEGF 蛋白含量 收集細胞培養(yǎng)上清液，5 000 g離心10 min，收集上清，具體操作過程按照試劑盒說明書進行，采用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的OD值，根據標準曲線計算細胞培養(yǎng)上清中sFlt?1、PIGF 和VEGF 蛋白含量。

1.2.6 Western blot 檢測細胞中相關蛋白表達 收集細胞并加入RIPA 細胞裂解液，置于冰上作用30 min，12 000 g 離心15 min，取上清液用BCA 法測定蛋白濃度并進行蛋白定量，經聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜，50 mol/L 脫脂牛奶封閉，加入一抗孵育過夜，稀釋比均為1∶500。4 ℃過夜，次日TBST 洗脫3 次，對應加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗脫3 次，用ECL 發(fā)光液發(fā)光顯色，在自動凝膠成像分析系統(tǒng)成像，使用Image J 軟件進行分析，以GAPDH 為內參計算總蛋白相對表達量。

1.2.7 Transwell 法檢測細胞侵襲和遷移能力 取24 孔板Transwell 小室，使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，以每孔2 × 105的細胞密度接種于PBS 提前濕潤的Transwell 小室上室聚碳酸酯微孔膜上，每孔加200 μL 無血清培養(yǎng)基。將600 μL 完全培養(yǎng)基加入下室，作為趨化因子，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察穿過掉入下室5 個細胞時終止培養(yǎng)，PBS 洗3 次，甲醛固定15 min，0.1%結晶紫溶液染色15 min，晾干后取出聚碳酸酯微孔膜。于顯微鏡下隨機計數(shù)5 個視野膜上的細胞數(shù)目，取其均值，代表細胞轉移能力。細胞侵襲實驗時Tran?swell 小室上室提前加入Matrigel 膠后接種細胞，剩下操作同遷移實驗。

1.2.8 小管形成實驗檢測細胞體外促血管形成能力 將Matrigel 基質膠提前放入4 ℃冰箱過夜，融化后加入到96 孔板中凝膠。取各組HUVEC 細胞上清液，2 000 g 離心5min，收集上清后重懸細胞并調整細胞濃度為2×105個/mL，隨后向鋪好基質膠的96 孔板中每孔加入100 μL 細胞懸液，置于37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀察細胞成管情況并拍照，并隨機取5 個視野統(tǒng)計小管形成數(shù)量取均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有實驗均重復3 次，采用SPSS 22 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或連續(xù)測量數(shù)據的方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ATRA 抑制HTR?8/SVneo 細胞中sFlt?1 的表達 見圖1，隨著0.15 μmol/L ATRA 處理時間的延長，HTR?8/SVneo 細胞中sFlt?1 mRNA 表達水平及上清液中sFlt?1 蛋白含量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（FsFlt?1mRNA=11.20，F(xiàn)sFlt?1蛋白=49.66，P＜0.001）。與0 h 時間點比較，0.15 μmol/L ATRA 處理24、48、72 h 時，HTR?8/SVneo 細胞中sFlt?1 mRNA 表達水平及上清液中sFlt?1 蛋白含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），根據該結果選擇24 h 作為后續(xù)實驗時間點。

圖1 ATRA 對HTR?8/SVneo 細胞中sFlt?1 表達的影響Fig.1 Effect of ATRA on the expression of sFlt?1 in HTR?8/SVneo cells

2.2 過表達sFlt?1 后HTR?8/SVneo 細胞中sFlt?1的表達水平 見圖2，與blank 組或Vector 組比較，Lv?sFlt?1 組細胞中sFlt?1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.001），表明成功構建sFlt?1 過表達的HTR?8/SVneo 細胞。

圖2 各組細胞中sFlt?1 mRNA 和蛋白表達水平Fig.2 The mRNA and protein expression levels of sFlt?1 in each group

2.3 ATRA 對HTR?8/SVneo 細胞中sFlt?1、PIGF和VEGF 蛋白分泌的影響 見圖3，與Control 組比較，ATRA 組細胞上清液中sFlt?1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），PIGF 和VEGF 蛋白含量顯著升高（P均＜0.01）；而Lv?sFlt?1 組細胞上清液中sFlt?1 蛋白含量顯著升高（P＜0.01），PIGF 和VEGF 蛋白含量顯著降低（均P＜0.05）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組細胞上清液中sFlt?1 蛋白含量顯著升高（P＜0.01），而PIGF 和VEGF 蛋白含量顯著降低（均P＜0.01）。2.4 ATRA 對HTR?8/SVneo 細胞侵襲和遷移能力的影響 見圖4、5，與Control 組比較，ATRA 組遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著增加（P＜0.001），而Lv?sFlt?1 組遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著減少（P＜0.001）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組侵襲和遷移細胞數(shù)目顯著減少（P＜0.001）。見圖6，與Control 組比較，ATRA 組細胞中MMP?9 和MMP?2蛋白水平均顯著上調（P＜0.001），而Lv?sFlt?1 組細胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白水平均顯著下調（P＜0.001）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組細胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白水平均顯著下調（P＜0.001）。

圖3 各組細胞上清液中sFlt?1、PIGF 和VEGF 蛋白含量比較Fig.3 Comparison of the protein contents of sFlt?1，PIGF and VEGF in the supernatant of each group

圖4 各組細胞遷移能力比較（×200）Fig.4 Comparison of the migration ability of cell in each group（×200）

圖5 各組細胞侵襲能力比較（×200）Fig.5 Comparison of the invasion ability of cell in each group（×200）

圖6 各組細胞中MMP?2 和MMP?9 蛋白表達水平Fig.6 Comparison of the protein expression levels of MMP?2 and MMP?9 in each group

2.5 ATRA 對HTR?8/SVneo 細胞促血管形成能力的影響 見圖7，與Control 組比較，ATRA 組細胞培養(yǎng)上清誘導的HUVEC 細胞血管成管數(shù)量顯著增加（P＜0.001），而Lv?sFlt?1 組細胞培養(yǎng)上清誘導的HUVEC 細胞血管成管數(shù)量顯著減少（P＜0.001）；與ATRA 組比較，ATRA+Lv?sFlt?1 組細胞培養(yǎng)上清誘導的HUVEC 細胞血管成管數(shù)量顯著減少（P＜0.001）。

圖7 各組細胞的促血管形成能力比較（×100）Fig.7 Comparison of the angiogenesis ability of the cells in each group（×100）

3 討論

ATRA 是維生素A 在體內的重要活性代謝產物，在胚胎發(fā)育、組織器官形成、細胞增殖、分化、代謝及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用［7?9］，但過量的ATRA 會導致胎兒畸形，包括消化道畸形、先天性馬蹄內翻足等。有研究顯示［6］，ATRA 在子癇前期患者子宮脫膜組織中含量較低，采用ATRA干預可導致子癇前期胎盤基底脫膜細胞中sFlt?1低表達，而采用ATRA 拮抗劑BMS493 干預可上調sFlt?1 表達，推測ATRA 有可能通過抑制sFlt?1 表達改善子癇前期胎盤血管發(fā)育異常。本研究結果顯示，ATRA 可能通過抑制sFlt?1 的表達促進滋養(yǎng)細胞的侵襲和血管生成，從而可能影響子癇前期的病理過程。

sFlt?1 是血管內皮生長因子受體?1（Flt?1）的稀有剪接形式，可與Flt?1 競爭性結合VEGF 和PIGF，使VEGF 和PIGF 生物學功能被抑制，造成胎盤血管生成障礙［10-11］。有研究利用不同藥物抑制sFlt?1水平達到了治療子癇前期的目的，例如硫酸鎂［12］、拉貝洛爾［13］、烏拉地爾和香丹注射液［14］等。本研究中首先采用ATRA 處理HTR?8/SVneo 細胞不同時間，發(fā)現(xiàn)ATRA 可抑制HTR?8/SVneo 細胞sFlt?1 mRNA 的表達及其蛋白的分泌，且呈時間依賴性，由此推測ATRA 可能抑制sFlt?1 表達。

本研究結果顯示，ATRA 處理可抑制HTR?8/SVneo 細胞分泌sFlt?1 蛋白，促進PIGF 和VEGF 蛋白分泌，同時可提高細胞的侵襲、遷移以及促血管形成能力；而sFlt?1 過表達可促進HTR?8/SVneo 細胞分泌sFlt?1 蛋白，抑制PIGF 和VEGF 蛋白分泌，并降低細胞促血管形成等能力；為了進一步探討ATRA 通過抑制sFlt?1 表達而發(fā)揮作用，本研究采用ATRA 干預sFlt?1 過表達的HTR?8/SVneo 細胞，結果顯示sFlt?1 過表達可逆轉ATRA 對HTR?8/SV?neo 細胞的干預效果，表明ATRA 是通過抑制sFlt?1表達，促進PIGF 和VEGF 的分泌，進而增強滋養(yǎng)層細胞促血管形成能力。此外，MMP?9 和MMP?2 是一類基質金屬蛋白酶，表達異常可影響滋養(yǎng)細胞的侵襲能力，導致血管重鑄不全［15］。研究表明［16-17］，子癇前期患者胎盤組織中MMP?2 和MMP?9 蛋白表達水平顯著降低。本研究結果顯示，ATRA 處理可促進HTR?8/SVneo 細胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白表達，而sFlt?1 過表達可顯著下調MMP?9 和MMP?2 蛋白表達水平；然而，sFlt?1 過表達又可抑制ATRA 干預對HTR?8/SVneo 細胞中MMP?9 和MMP?2 蛋白表達的上調作用。因此，ATRA 可能通過抑制sFlt?1表達，促進MMP9 和MMP2 蛋白的表達，進而提高滋養(yǎng)細胞的侵襲與遷移能力。

綜上所述，ATRA 可能通過抑制sFlt?1 調控PIGF 和VEGF 的表達，促進滋養(yǎng)細胞的侵襲及促血管形成能力，因而ATRA 可能具有改善子癇前期的效果。本研究的新穎之處是首次探討了ATRA對滋養(yǎng)細胞sFlt?1表達以及對其侵襲和促血管形成能力的影響，但不足之處是未在動物水平進行驗證，因此下一步的研究方向將會進行動物體內探究。