LncRNA PANDAR、miR-637表達與甲狀腺癌臨床病理參數(shù)及預后的關系

敖雪仁 廖 聰 馬凱敏 沈國喜

廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院外科，廣東廣州 510385

甲狀腺癌來源于甲狀腺上皮細胞，是內分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1-2]。全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，2018 年全球甲狀腺癌的診斷患者約占全部癌癥的3.2%[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）PANDAR 是一種新型LncRNA，在多種癌癥中均有高表達，如舌鱗狀細胞癌、胃癌等[4-5]。有研究顯示，LncRNA PANDAR 在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，具有多種生物學功能，如調節(jié)細胞凋亡及侵襲、誘導多功能干細胞基因再編輯等[6]。微小RNA（microRNA，miRNA）具有多種生物學功能，如與靶基因mRNA 互補結合進而抑制其基因轉錄及蛋白質翻譯，進而在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如促進癌細胞的增殖、分化、侵襲及上皮-間質轉化等過程[7]。miR-637 在多種腫瘤組織中均表達下調，如神經膠質瘤、肝癌等[8-9]，可抑制癌細胞的生長，具有一定抑癌作用。因此，本研究分析兩個指標在甲狀腺癌中的表達及其與患者臨床特征及預后的關系，為患者治療提供新的科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2017 年2 月于廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院住院治療的甲狀腺癌患者82例。納入標準：①病理診斷甲狀腺癌；②首次患病；③臨床病理資料完整并接受隨訪，且簽署知情同意書。排除標準：①患有同系統(tǒng)其他相關疾病，如甲狀腺功能減退癥等；②患有重要臟器疾病，如冠心病等；③患有其他惡性腫瘤。

1.2 研究方法

收集術中獲取的甲狀腺癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣超過5 cm，經病理證實），冷凍保存并立即送檢。取100 mg 組織標本，應用TRIzol 法提取總RNA（試劑盒購于Biosharp 公司，貨號：20160911），使用紫外分光光度儀檢測RNA 濃度，符合標準的RNA 凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂肦NA 逆轉錄試劑盒（購于日本TaKaRa 公司，貨號：20141112）將提取出的RNA 進行反轉錄成cDNA，反應體系：Enzyme Mix 1 μl、5×RT Buffer 4 μl、Primer Mix 4 μl、ddH2O 11 μl，共20 μl 體系；反應條件：37℃60 min，90℃30 s。以cDNA 為模板，使用PCR 擴增試劑盒（購于蘇州泓迅生物科技股份有限公司，貨號：20151107）進行PCR 擴增，所有引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，LncRNA PANDAR 正向引物：5’-CTGTTAAGGTGGTGGCATTG-3’，反向引物：5’-GGAGGCTCATACTGGCTGAT-3’；內參GAPDH 正向引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-637 正向引物：5’-AGCCCACACACTACAGGCA-3’，反向引物：5’-GCACAAAAGCAGTACGACCT-3’；內參U6 正向引物：5’-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3’，反向引物：5’-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3’；反應體系：10 μl 2×SYBR Green，1 μl 20×TaqDNA 聚合酶，上下游引物各0.5 μl和8 μl ddH2O。qPCR 反應條件：95℃預變性5 min，55℃變性1 min，72℃延伸10 s，共40 個循環(huán)。最后結果以2-ΔΔCt來計算和標準化LncRNA PANDAR 與miR-637的相對表達量。

1.3 觀察指標

比較甲狀腺癌組織與癌旁正常組織中LncRNA PANDAR 與miR-637的表達，分析二者間的相關性；分析甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR 與miR-637與臨床病理特征的關系；以LncRNA PANDAR的表達中位數(shù)3.24 為臨界值，分為LncRNA PANDAR 高表達組43例，LncRNA PANDAR 低表達組39例，以miR-637的表達中位數(shù)5.13 為臨界值，分為miR-637高表達組44例和miR-637 低表達組38例，從患者出院日起，每1～3 個月隨訪1 次，包括門診或電話兩種隨訪方式，隨訪時間為3～36 個月，隨訪至終止時間或患者死亡，隨訪時間截止至2020 年2 月。比較高、低表達組患者預后3 年生存率。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 線性相關分析，采用Kaplan-Meier檢驗分析LncRNA PANDAR、miR-637 與患者預后的關系。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA PANDAR 與miR-637的表達及相關性分析

甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR的相對表達量高于癌旁組織，miR-637的相對表達量低于癌旁組織（P ＜0.05）。見表1。Pearson 相關分析結果顯示，LncRNA PANDAR 與miR-637的表達呈負相關（r=-0.634，P ＜0.05）。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織LncRNA PANDAR與miR-637的相對表達量比較（±s）

表1 癌組織及癌旁組織LncRNA PANDAR與miR-637的相對表達量比較（±s）

注：LncRNA：長鏈非編碼RNA；miR-637：微小RNA-637

2.2 甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR 及miR-637與臨床參數(shù)的關系

甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR、miR-637的表達與腫瘤TNM 分期、淋巴轉移、細胞分化程度有關（P ＜0.05），與患者性別、年齡、病理類型、病灶特點及腫瘤直徑無關（P ＞0.05）。見表2。

表2 甲狀腺組織中LncRNA PANDAR 及miR-637與臨床參考的關系（±s）

表2 甲狀腺組織中LncRNA PANDAR 及miR-637與臨床參考的關系（±s）

注：LncRNA：長鏈非編碼RNA；miR-637：微小RNA-637

2.3 LncRNA PANDAR、miR-637表達與患者預后的關系

82例甲狀腺癌患者均隨訪成功，無失訪患者。隨訪3 年內，共有16例患者死亡。LncRNA PANDAR 高表達組3 年總體生存率（overall survival，OS）為69.77%（30/43），LncRNA PANDAR 低表達組3 年OS 為92.31%（36/39），Kaplan-Meier 分析顯示，LncRNA PANDAR高表達組3 年OS 低于LncRNA PANDAR 低表達組（χ2=5.726，P=0.032）。miR-637 高表達組3 年OS為86.36%（38/44），miR-637 低表達組3 年OS 為73.68%（28/38），Kaplan-Meier 分析顯示，兩組患者3 年生存率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.710，P=0.059）。見圖1。

圖1 不同表達LncRNA PANDAR、miR-637 患者3 年生存率

3 討論

LncRNA 是一個長度約為200 個核苷酸的非編碼RNA的轉錄本[10-11]。最近的研究顯示，LncRNA 在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，如胃癌、乳腺癌等[12-13]，通過影響、調節(jié)細胞生長過程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。LncRNA PANDAR 是CDKN1A 反義DNA 損傷激活RNA的啟動子，染色體位置為6p21.2，是近些年來的研究熱點。有研究顯示，乳腺癌組織中LncRNA PANDAR表達上調，其可通過促進p16（INK4A）的表達進一步促進乳腺癌細胞的增殖、遷移等過程的發(fā)生[14]。同時，LncRNA PANDAR 在膀胱癌組織中也呈高表達狀態(tài)，且LncRNA PANDAR的上調與腫瘤分期、淋巴轉移及不良預后相關[15]。本研究顯示，LncRNA PANDAR 在甲狀腺癌組織中表達上調，并且LncRNA PANDAR表達與甲狀腺癌患者TNM 分期、淋巴結轉移、細胞分化程度相關，提示LncRNA PANDAR 可能參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。LncRNA PANDAR 可通過上調波形蛋白、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9的表達，下調E-鈣黏蛋白表達來促進上皮間質轉化過程，進而提升腫瘤細胞的侵襲及轉移能力，促進了腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展[16-17]。此外，LncRNA PANDAR 還可以激活腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子信號通路PI3K/AKT，上調PI3K的表達，刺激腫瘤細胞的生長，上調B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）的表達，抑制腫瘤細胞的凋亡，減少腫瘤細胞的凋亡數(shù)量，促進腫瘤細胞的增殖及分化，提高腫瘤細胞的惡性程度，進而影響甲狀腺癌的進展[18]。

miRNA 是一種長度約為20 個核苷酸的非編碼RNA，可以與靶基因mRNA的3’UTR 區(qū)結合，影響靶基因的轉錄及翻譯過程，進而參與細胞生理過程[19-20]。異常表達的miRNA 可影響多種生物學過程，如表達異常的miRNA 可以以原癌基因的形式促進腫瘤的形成[21]。miR-637 是較早發(fā)現(xiàn)的miRNA 之一，位于染色體19p13.3，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如miR-637 可通過抑制轉錄激活因子3 進而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[22]。本研究結果顯示，miR-637 在甲狀腺癌組織中表達降低，并與細胞分化程度、淋巴結轉移、腫瘤TNM 分期相關，初步顯示miR-637 在甲狀腺癌細胞增殖、分化病理過程中發(fā)揮作用。AKT1 是P13K/Akt 信號通路中的上游蛋白，其磷酸化過程激活了該通路并調節(jié)腫瘤細胞的增殖和凋亡。已有研究證實，miR-637 可直接與AKT1的3’-UTR 結合，介導AKT1的降解并下調其表達水平，進而抑制轉錄因子Foxo1、細胞周期蛋白D1的表達，最終抑制了腫瘤細胞生長過程，抑制了腫瘤的惡性進展[23]。此外，miR-637 還可抑制Bcl-2 并上調促凋亡因子Bax的表達，提示其亦具有促進腫瘤細胞凋亡的功能，有顯著抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及向周圍組織轉移的能力[24-25]。

Kaplan-Meier 生存曲線分析結果顯示，LncRNA PANDAR 低表達組術后3 年生存率高于LncRNA PANDAR 高表達組，而不同表達水平的miR-637 對患者術后3 年生存率無明顯影響。初步證實了LncRNA PANDAR 與甲狀腺癌患者術后不良預后相關，具有作為預測甲狀腺癌患者預后的潛能。本研究結果還顯示，LncRNA PANDAR 與miR-637 呈負相關，LncRNA PANDAR 可激活信號通路PI3K/AKT，上調PI3K 及AKT的表達，從而對腫瘤的發(fā)展起到了促進作用[18]，而miR-637 卻可抑制PI3K/AKT 通路中的蛋白AKT1的表達，提示miR-637 對PI3K/AKT 信號通路亦具有一定的抑制作用[23]，抑制腫瘤細胞的增殖及分化過程，因此推測LncRNA PANDAR 與miR-637 具有負相關性，但是具體的作用機制還需在后續(xù)細胞水平進行驗證。

綜上所述，甲狀腺癌組織中LncRNA PANDAR呈高表達、miR-637 呈低表達，與細胞分化程度、腫瘤TNM 分期及淋巴轉移有關，檢測兩個指標的表達有助于甲狀腺癌患者病情的判斷。