甲狀腺癌組織中長鏈非編碼RNA漿細胞瘤變體易位1和微小RNA-195-5p表達及臨床意義

李小玲 邵 馨 郭 玲 楊亞麗

1.江蘇省常州市中醫醫院病理科，江蘇常州 213000；2.南通大學附屬啟東醫院病理科，江蘇啟東 226200；3.云南省第二人民醫院病理科，云南昆明 650021

甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，發病率逐年上升，嚴重影響人類健康[1]。盡管甲狀腺癌的治療技術較成熟，但對于晚期甲狀腺癌和惡性度較高的病理類型術后的復發率仍較高。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）不能參與轉錄和翻譯過程，但可以參與基因網絡的調節，從而調控蛋白質活性[2]。漿細胞瘤變體易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）位于染色體8q24.21，包含1716個堿基，在乳腺癌中其基因拷貝數明顯增加，可能對乳腺癌的進展具有一定影響[2]。研究發現[3]，沉默lncRNA PVT1 能夠促進黑色素瘤細胞凋亡，抑制其增殖活性，通過誘導其靶基因使癌細胞停滯在G0/G1期。微小RNA（miRNA）是在細胞中廣泛存在的非編碼RNA 分子，能夠參與個體形態形成、脂類代謝以及胚胎發育等生命活動。研究顯示[4]，miR-195-5p 能夠抑制細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白活性，使癌細胞阻滯在G1/S 期，從而抑制癌細胞的分化和增殖。有研究發現[5]，lncRNA PVT1和miR-195-5p 均可作用于多梳蛋白共同參與癌變進展。因此，本研究旨在探討甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析江蘇省常州市中醫醫院（以下簡稱“我院”）于2017 年4 月至2020 年1 月收治的82例甲狀腺癌患者的臨床資料。納入標準：①符合《世界衛生組織腫瘤分類診斷系統》[6]中的診斷原則，且術后病理證明為甲狀腺癌；②均自愿配合本研究，且具有完整的基本資料；③首次確診。排除標準：①合并嚴重甲狀腺功能亢進；②伴有巨大甲狀腺腫或橋本性甲狀腺炎者；③合并其他原發性惡性腫瘤者；④先天性免疫功能障礙者；⑤嚴重肝腎功能不良者而不能耐受手術或放化療者。同時按照1∶1 選取同期我院年齡性別相匹配的82例行甲狀腺部分切除術的甲狀腺良性腫瘤作為對照。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

采用熒光實時定量PCR技術測量lncRNA PVT1和miR-195-5p的相對表達量。將術中切取的甲狀腺癌組織、癌旁正常組織（距癌組織邊緣3 cm 處）及甲狀腺良性腫瘤組織各30 mg 放入液氮中暫存，術后轉存于-80℃冰箱中。先在冰面上研磨均勻，然后滴加1 ml Trizol 試劑（Invitrogen 公司；批號：20170321）提取總RNA。將總RNA 通過PrimeScriptTMRT reagent Kit 試劑盒（TaKaRa 公司；批號：20170126）反轉錄為cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa 公司；批號：20170219）定量檢測，逆轉錄條件均為37℃15 min，85℃5 s。PCR 擴增體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μl、dH2O 7.8 μl、Rox 0.4 μl、cDNA template 1.0 μl 及正反向引物各0.4 μl，共20.0 μl。miR-195-5p的正向引物序列為5’-GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3’、反向引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，內參基因β-actin的正向引物序列為5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’、反向引物序列為5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’；lncRNA PVT1正向引物序列為5’-GCTGTGGCTGAATGCCTCAT-3’、反向引物序列為5’-TTCACCAGGAAGAGTCGGGG-3’，內參基因GAPDH 正向引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’、反向引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。lncRNA PVT1和miR-195-5p的PCR 反應條件均為預變性95℃3 min、變性95℃15 s、退火65℃30 s、延伸72℃20 s，擴增40 個循環，樣本均測量3 次。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司負責制造。以相對Ct 值法檢測lncRNA PVT1和miR-195-5p的表達量，以ΔCt 值作為結果，二者相對于GAPDH和β-actin的比值為2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct 目的基因ΔCt 內參基因。

1.3 統計學方法

SPSS 22.0 軟件統計分析數據。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較應用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。兩組間比較應用獨立樣本t 檢驗。相關性檢驗應用Pearson 相關分析。以P ＜0.05 為差異有統計學差異。

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p相對表達量比較

甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1 相對表達量高于甲狀腺良性腫瘤組織及癌旁正常組織、而miR-195-5p 相對表達量低于甲狀腺良性腫瘤組織及癌旁正常組織（均P ＜0.05），癌旁正常組織與甲狀腺良性腫瘤組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p 相對表達量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1、表1。

表1 不同甲狀腺組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p相對表達量比較（±s）

表1 不同甲狀腺組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p相對表達量比較（±s）

注：與癌旁正常組織比較，aP ＜0.05；與甲狀腺良性腫瘤組織比較，bP ＜0.05。lncRNA PVT1：長鏈非編碼RNA漿細胞瘤變體易位1；miR-195-5p：微小RNA-195-5p

圖1 lncRNA PVT1、miR-195-5p 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p表達與臨床病理的關系

甲狀腺癌組織，lncRNA PVT1 在有淋巴結轉移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期中相對表達量高于無淋巴結轉移及Ⅰ～Ⅱ期；miR-195-5p 在有淋巴結轉移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期中相對表達量低于無淋巴結轉移及Ⅰ～Ⅱ期（均P ＜0.05）；二者在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型中表達量比較，差異無統計學意義（均P ＞0.05）。見表2。

表2 甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1和miR-195-5p表達與臨床病理的關系（±s）

表2 甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1和miR-195-5p表達與臨床病理的關系（±s）

注：lncRNA PVT1：長鏈非編碼RNA漿細胞瘤變體易位1；miR-195-5p：微小RNA-195-5p

2.3 甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p表達相關性

甲狀腺癌組織中，miR-195-5p表達和lncRNA PVT1表達呈負相關（r=-0.731，P <0.001）。見圖2。

圖2 甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1、miR-195-5p表達相關性

3 討論

甲狀腺癌最常見病理類型為乳頭狀癌，基因易感性和環境因素的相互作用是導致甲狀腺癌發生的關鍵[7-9]。表觀遺傳是近年來熱點研究領域，lncRNA 調控、組蛋白修飾、DNA 拷貝數改變、DNA 甲基化及乙酰化等參與調控腫瘤細胞的增殖和分化，改變腫瘤微環境，影響腫瘤的演化過程[10-12]。LncRNA PVT1 位于原癌基因c-myc 基因下游，通過結合CDK4 誘導c-myc表達，促進腫瘤發生和進展[13]。基礎實驗顯示[14]，lncRNA PVT1 高表達使胃癌患者對順鉑產生一定的耐藥性，影響化療效果。其他研究發現[2]lncRNA PVT1 能夠激活Zeste 同源物增強子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2），使p16表達上調，促進癌細胞增殖及分化。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1 相對表達量上升。其機制可能為癌組織中原癌基因c-myc表達上調，從而激活其下游靶基因lncRNA PVT1，使其相對表達量增加[13]。本研究發現甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1表達與淋巴結轉移和TNM 分期有關，提示lncRNA PVT1 在甲狀腺癌的演化過程中發揮重要作用。可能的機制為lncRNA PVT1 上調誘導EZH2基因表達，而活化的EZH2 基因通過結合轉錄因子E2F，使細胞周期中的G1期縮短，從而使癌細胞迅速增殖，同時，活化的EZH2 基因也能使干細胞的分化功能受阻，從而抑制正常組織的修復作用，間接導致癌細胞的侵襲力增強[2]。此外，lncRNA PVT1表達上調后可以增強上皮-間質轉化相關因子ZEB1和ZEB2的活性，使癌細胞的黏附能力下降、極性喪失，從而使其遷移能力增加，加速腫瘤進展[15]。

MiR-195-5p 屬于miR-15 家族，位于17號染色體，在宮頸癌和肝癌等多種癌癥中具有抑癌基因作用[5,16]。研究發現[5]，miR-195-5p 能夠抑制多梳蛋白樣基因3表達，使多梳蛋白轉錄受阻，從而導致胚胎干細胞自我更新能力增強以及減弱對同源功能基因沉默的作用，對抑制腫瘤細胞的形成和生長具有作用。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中miR-195-5p 相對表達量下降。其機制可能為癌組織中的DNA 甲基轉移酶使miR-195-5p的啟動子區域形成CpG 島，誘導miR-195-5p 自身發生甲基化，使其基因沉默，從而使miR-195-5p表達下調[17]。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中miR-195-5p表達與淋巴結轉移和TNM 分期有關。其原因可能為下調的miR-195-5p 對成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）的抑制能力減弱，而FGF2 是細胞增殖和血管生成的重要因子，其功能的增強可以促進癌細胞無限增殖并誘導癌周組織形成新生血管，從而促進癌細胞的侵襲和轉移[18-19]。此外，miR-195-5p 相對表達量降低使細胞周期蛋白依賴性激酶8（cyclin-dependent kinases 8，CDK8）的活性增強，而CDK8 通過RNA 聚合酶Ⅱ轉錄調節物12 使大量細胞進入G1/S 期，導致癌細胞分裂的細胞周期縮短，增強癌細胞的增殖和分化能力[20-21]。

本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中miR-195-5p和lncRNA PVT1表達量呈負相關，提示lncRNA PVT1可能與miR-195-5p 相互作用，進而調控甲狀腺癌的進展。研究顯示[22]，lncRNA PVT1 能夠激活miR-195-5p啟動子區域的組蛋白H3K27me3，從而使miR-195-5p基因沉默。既往報道指出[23-24]，lncRNA PVT1可以作為miRNA的分子海綿，以吸附結合的方式影響miRNA表達。同時，lncRNA PVT1 結合miR-195-5p 后，抑制端粒酶逆轉錄酶能力減弱，加速甲狀腺癌進展[25]。由于研究設備的限制，miR-195-5p和lncRNA PVT1的具體機制仍有待深入研究。

綜上，甲狀腺癌組織中lncRNA PVT1表達上調，而miR-195-5p表達下調，二者均與淋巴結轉移和TNM 分期有關，對評估患者病情及確定治療靶點具有潛在應用價值。