miR-150-5p 通過調控DDR1 表達對缺氧缺糖誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的影響①

王立俠 韓金芬 馬明明 （鄭州市第七人民醫院神經電生理室，鄭州450000）

缺血性腦卒中又稱腦梗死，是由腦部供血障礙而引起的局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化，其發病率和致殘率較高，是導致人類死亡和殘疾的主要原因之一［1-2］。研究顯示，miRNA 在急性缺血性腦卒中發生發展中具有重要作用［3］。研究報道，miR-150-5p 與缺血性腦卒中患者二級預防治療的中期預后有關，參與腦血栓形成的生理病理過程［4］。缺血性腦卒中患者外周血miR-150-5p 表達顯著降低，可作為缺血性腦卒中的生物標志物［5］。盤狀結構域受體1（discoidin domain receptor 1，DDR1）是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，其激活可活化一系列細胞內外信號傳導，參與多種疾病過程［6］。抑制DDR1 活化可降低缺氧缺血腦損傷新生鼠皮層組織中微管相關蛋白Tau 磷酸化水平，促進乙酰膽堿釋放，DDR1 抑制劑對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有保護作用［7］。但miR-150-5p對缺血性腦損傷的影響及機制尚未闡明。研究發現，缺氧缺糖可導致神經元損傷［8］。本研究采用缺氧缺糖（oxygen-glucose depri?vation，OGD）處理大鼠大腦皮質神經細胞建立神經損傷模型，探究miR-150-5p對OGD 誘導的大鼠大腦皮質神經細胞損傷的影響及其機制是否與DDR1相關，為相關腦疾病治療提供新的生物標志物和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級孕16~18 d SD 大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.1.2 主要試劑與儀器 Neurobasal 培養基、B27、高糖DMEM、無糖DMEM 培養基購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自Hyclone 公司；熒光定量試劑盒購自美國 Progema 公司；RIPA 蛋白裂解液、BCA 試劑盒購自江蘇碧云天公司；MTT 試劑盒購自美國Sig?ma 公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）、碘化丙啶（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京So?larbio 公司；CO2孵育箱、Thermo FC 酶標儀購自美國Thermo 公司；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮質神經細胞分離培養 無菌條件下分離大鼠大腦皮層組織，剪成1~2 mm3組織塊，0.25%胰蛋白酶消化15 min，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基終止消化，離心得細胞沉淀，重懸，過200 目篩，離心，置于神經元專用培養基（98%Neurobasal+2%B27），輕輕吹打制成細胞懸液，接種于預先包被過L-多聚賴氨酸的6 孔板中，37℃、5%CO2培養。

1.2.2 OGD模型建立與細胞分組 取培養5 d的原代大腦皮層神經元，棄培養基，加入無糖DMEM培養基（無糖DMEM 預先放入缺氧培養箱中去除培養基中的氧氣），置于缺氧培養箱（37℃、95%N2、5%CO2）進行OGD 培養90 min，換為神經元專用培養基繼續培養，正常對照（Con）組不做任何OGD 處理。將miRNC、miR-150-5p、anti-miR-NC、anti-miR-150-5p 轉染至皮層神經細胞，記為miR-NC組、miR-150-5p組、an?ti-miR-NC 組、anti-miR-150-5p 組；將 miR-NC、miR-150-5p、si-NC、si-DDR1 轉染至皮層神經細胞后進行OGD 處理，記為 OGD+miR-NC 組、OGD+miR-150-5p組、OGD+si-NC 組、OGD+si-DDR1 組；將 miR-150-5p分別與pcDNA、pcDNA-DDR1 共轉染至皮層神經細胞后再進行OGD 處理，記為OGD+miR-150-5p+pcD?NA組、OGD+miR-150-5p+pcDNA-DDR1組。

1.2.3 RT-qPCR 檢測 miR-150-5p、DDR1 mRNA 表達 提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，按熒光定量說明進行PCR反應，各樣品設3個重復，反應條件為95℃ 30 s，60℃ 40 s；72℃ 30 s，共40 個循環；60℃ 延長 5 min，2?ΔΔCt法計算。miR-150-5p 和 DDR1 分別以U6 和 GAPDH 為 內 參 ，miR-150-5p F：5'-CGCTCTCTCCCAACCCTTGTACC-3'，R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 F：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'；DDR F：5'-ACTTTGGCATGAGCCGGAAC-3'，R：5'-ACGTCACTCGCAGTCGTGAAC-3'；GAPDH F：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，R：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 Western blot 法檢測 DDR1、Bcl-2、Bax 蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量，配膠，上樣，SDS-PAGE 轉膜，封閉液封閉90 min，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，底物反應、顯影、定影，掃描儀掃描膠片，Image軟件分析各目的條帶灰度值，以GAPDH 為內參，分析各組目的蛋白表達。

1.2.5 MTT 檢測細胞存活率 收集細胞，加入MTT 孵育 4 h，吸取上清，加入 DMSO，搖勻，酶標儀測量吸光度（OD）。細胞存活率（%）=OD實驗組/OD空白對照組×100%。

1.2.6 LDH釋放率檢測 收集培養基上清和細胞，根據說明書進行LDH釋放量檢測。LDH釋放率（%）=LDH上清/（LDH上清+LDH細胞）×100%。

1.2.7 細胞凋亡率檢測 收集細胞，預冷PBS 漂洗，加入結合緩沖液重懸，加入Annexin V-FITC和PI混勻后避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-150-5p 和DDR1 靶向關系 構建含miR-150-5p 結合位點的DDR1 野生型載體和突變型載體，分別與miR-NC、miR-150-5p共轉染至皮層神經細胞中，轉染48 h，根據說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，數據以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-150-5p 和 DDR1 在 OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞中的表達 與對照組相比，OGD 組大鼠皮質神經細胞中miR-150-5p 表達降低，DDR1 mRNA和蛋白表達升高（P<0.05，圖1、表1）。

表1 miR-150-5p 和DDR1 在OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞中的表達（，n=9）Tab.1 Expressions of miR-150-5p and DDR1 in OGD-in?duced rat cortical neural cells（，n=9）

表1 miR-150-5p 和DDR1 在OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞中的表達（，n=9）Tab.1 Expressions of miR-150-5p and DDR1 in OGD-in?duced rat cortical neural cells（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

DDR1 protein 0.56±0.05 0.92±0.081）11.448 0.000 Groups Con OGD t P miR-150-5p 1.00±0.08 0.43±0.041）19.118 0.000 DDR1 mRNA 1.01±0.09 3.42±0.341）20.557 0.000

圖1 DDR1蛋白表達Fig.1 Expression of DDR1 protein

2.2 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞存活率和LDH 釋放的影響 與對照組相比，OGD 組miR-150-5p 表達降低，細胞存活率降低，LDH 釋放率升高（P<0.05）；與 OGD+miR-NC 組相比，OGD+miR-150-5p 組 miR-150-5p 表達升高，細胞存活率升高，LDH釋放率降低（P<0.05，表2）。

表2 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞存活率和LDH釋放的影響（，n=9）Tab.2 Effect of miR-150-5p overexpression on survival rate and LDH release of rat cortical neurons in?duced by OGD（，n=9）

表2 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞存活率和LDH釋放的影響（，n=9）Tab.2 Effect of miR-150-5p overexpression on survival rate and LDH release of rat cortical neurons in?duced by OGD（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with OGD+miRNC group，2）P<0.05.

miR-150-5p Groups Survival rate（%）1.00±0.08 0.42±0.041）0.41±0.03 0.86±0.082）215.745 0.000 Con OGD OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p F P 100.00±13.26 48.25±4.361）45.28±4.57 78.69±7.252）91.449 0.000 LDH release rate（%）9.25±0.93 36.21±3.541）39.47±3.85 14.29±1.442）276.368 0.000

2.3 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞凋亡的影響 與對照組相比，OGD 組細胞凋亡率升高，Bcl-2 表達降低，Bax 表達升高（P<0.05）；與 OGD+miR-NC 組相比，OGD+miR-150-5p 組細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達升高，Bax 表達降低（P<0.05，圖2、表3）。

圖2 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons

表3 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞凋亡的影響（，n=9）Tab.3 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons（，n=9）

表3 miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞凋亡的影響（，n=9）Tab.3 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with OGD+miRNC group，2）P<0.05.

Bax protein 0.31±0.03 0.76±0.071）0.77±0.06 0.38±0.042）195.164 0.000 Groups Con OGD OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p F P Apoptotic rate（%）7.36±0.74 26.58±2.611）28.36±2.71 11.69±1.132）250.038 0.000 Bcl-2 protein 0.69±0.06 0.23±0.031）0.22±0.03 0.61±0.062）245.167 0.000

2.4 抑制DDR1 表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的影響 與OGD+si-NC 組相比，OGD+si-DDR1 組 DDR1 表達降低，細胞存活率升高，LDH 釋放率降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達升高，Bax 表達降低（P<0.05，圖3、表4）。

表4 抑制DDR1表達對OGD誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的影響（，n=9）Tab.4 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

表4 抑制DDR1表達對OGD誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的影響（，n=9）Tab.4 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with OGD+si-NC group，2）P<0.05.

Bax protein 0.32±0.03 0.75±0.071）0.77±0.06 0.42±0.042）171.600 0.000 Groups Con OGD OGD+si-NC OGD+si-DDR1 F P DDR1 protein 0.51±0.05 0.93±0.081）0.95±0.09 0.59±0.052）95.692 0.000 Survival rate（%）100.00±9.32 49.32±4.331）46.28±4.71 71.36±7.252）123.065 0.000 LDH release rate（%）8.36±0.84 38.41±3.881）41.25±4.31 19.65±1.872）233.033 0.000 Apoptotic rate（%）6.59±0.66 27.39±2.771）28.43±2.85 15.62±1.512）209.584 0.000 Bcl-2 protein 0.68±0.06 0.22±0.021）0.21±0.03 0.56±0.052）277.743 0.000

圖3 抑制DDR1 表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons

2.5 miR-150-5p 靶向調控 DDR1 表達 StarBase 預測顯示，miR-150-5p 與DDR1 存在結合位點（圖4）。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC 組相比，miR-150-5p 組中轉染DDR1 野生型表達載體的細胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而轉染DDR1 突變型表達載體的細胞熒光素酶活性差異無統計學意義（表 5）。與 miR-NC 組相比，miR-150-5p 組 DDR1 表達顯著升高（P<0.05），與anti-miR-NC 組相比，antimiR-150-5p組DDR1表達顯著降低（P<0.05，表6）。

表5 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.5 Double luciferase report experiments（，n=9）

表5 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.5 Double luciferase report experiments（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-DDR1 1.01±0.08 1.03±0.07 0.564 0.580 Groups miR-NC miR-150-5p t P WT-DDR1 1.00±0.09 0.44±0.041）17.058 0.000

表6 miR-150-5p調控DDR1蛋白表達（，n=9）Tab.6 miR-150-5p regulates DDR1 protein expression（，n=9）

表6 miR-150-5p調控DDR1蛋白表達（，n=9）Tab.6 miR-150-5p regulates DDR1 protein expression（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with antimiR-NC group，2）P<0.05.

DDR1 protein 0.55±0.05 0.22±0.021）0.53±0.04 0.96±0.082）304.404 0.000 Groups miR-NC miR-150-5p anti-miR-NC anti-miR-150-5p F P

圖4 miR-150-5p靶向調控DDR1表達Fig.4 miR-150-5p targets DDR1 expression

2.6 DDR1 過表達逆轉miR-150-5p 過表達對OGD誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的作用 與OGD+miR-150-5p+pcDNA 組相比，OGD+miR-150-5p+pcD?NA-DDR1 組DDR1 表達升高，細胞存活率降低，LDH釋放率升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達降低，Bax表達升高（P<0.05，表7、圖5）。

表7 DDR1過表達逆轉miR-150-5p過表達對OGD誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的作用（，n=9）Tab.7 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

表7 DDR1過表達逆轉miR-150-5p過表達對OGD誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的作用（，n=9）Tab.7 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuronal injury（，n=9）

Note：Compared with OGD+miR-NC group，1）P<0.05；compared with OGD+miR-150-5p+pcDNA group，2）P<0.05.

Groups DDR1 protein Survival rate（%）Bcl-2 protein Bax protein 0.78±0.07 0.37±0.031）0.35±0.04 0.67±0.062）152.155 0.000 OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p OGD+miR-150-5p+pcDNA OGD+miR-150-5p+pcDNA-DDR1 F P 0.94±0.08 0.43±0.041）0.42±0.03 0.81±0.072）183.478 0.000 44.39±4.28 77.58±7.751）79.65±7.36 52.11±5.322）71.169 0.000 LDH release rate（%）37.54±3.87 13.46±1.331）12.58±1.26 31.65±3.142）205.674 0.000 Apoptotic rate（%）27.55±2.71 11.02±1.131）10.47±1.08 22.32±2.252）173.887 0.000 0.22±0.03 0.62±0.061）0.63±0.05 0.32±0.032）199.101 0.000

圖5 DDR1 過表達逆轉miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞凋亡的作用Fig.5 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuro?nal apoptosis

3 討論

缺血性腦損傷是臨床常見疾病，缺血性神經細胞凋亡與腦損傷發生密切相關，研究其作用分子機制對腦損傷防治具有重要意義［9］。氧化應激在缺血缺氧性腦損傷中具有重要作用［10］。本研究采用OGD 法誘導大鼠大腦皮質神經細胞，結果顯示，細胞存活率降低，LDH 釋放率升高，細胞凋亡率升高，說明OGD 可誘導大腦皮質神經細胞凋亡和氧化應激。研究報道，miR-24 抑制劑可預防缺血性卒中神經元凋亡［11］。miR-let-7c-5p 過表達通過抑制神經炎癥和調節小膠質細胞活化，改善創傷性腦損傷誘導的神經功能障礙和腦水腫［12］。說明miRNA 參與調控缺血性卒中及腦神經損傷。較低水平的miR-150-5p 與死亡率獨立相關，miR-150-5p 可降低急性缺血性中風后 90 d 內的死亡率風險［13］。miR-150 通過調節細胞凋亡保護小鼠心臟免受缺血性損傷［14］。本研究結果顯示，OGD 誘導的皮質神經細胞中miR-150-5p 呈低表達。過表達miR-150-5p，細胞存活率升高，LDH釋放率降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達升高，Bax 水平降低，提示過表達miR-150-5p 可促進細胞存活，抑制LDH 釋放和細胞凋亡，可保護OGD誘導的大腦皮質神經細胞損傷。

研究報道，氧糖剝奪損傷的神經元細胞中DDR1 蛋白表達增加［15］。大鼠局灶性腦缺血后DDR1表達升高，DDR1可能在腦缺血再灌注后破壞血腦屏障中起關鍵作用［16］。miR-199a-5p 通過下調大鼠DDR1預防腦缺血性損傷［17］。高遷移率簇蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）通過上調DDR1 表達和下調心肌細胞缺氧/復氧損傷后雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）磷酸化促進細胞凋亡和上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT），并誘導自噬［18］。本研究顯示，OGD 誘導的皮質神經細胞中DDR1 呈高表達，抑制DDR1表達可促進細胞存活，減少LDH釋放和細胞凋亡，且miR-150-5p 靶向調控DDR1，DDR1過表達逆轉miR-150-5p 過表達對OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞損傷的保護作用。

綜上所述，過表達miR-150-5p 可能通過下調DDR1 表達保護OGD 誘導的大鼠皮質神經細胞損傷，為治療缺血性腦損傷相關疾病提高新思路和靶點。