實驗性免疫性不育雄性小鼠濾泡輔助性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平分析①

曹曉丹 魏任雄 張曉霞 周 俊 （浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波中醫(yī)院男科實驗室，寧波315010）

不育癥日益受到社會的廣泛關(guān)注，我國約有15%~20%的育齡夫婦不能生育，男性因素約占50%［1-4］。免疫性不育是在某些外因或內(nèi)因的誘發(fā)下，自身免疫耐受狀態(tài)被打破，持續(xù)遷延的自身免疫對自身抗原產(chǎn)生異常的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生。濾泡輔助性T（T follicular helper，Tfh）細(xì)胞由 IL-21 等誘導(dǎo) Th0 分化產(chǎn)生，是真正意義上輔助B 細(xì)胞的一群新的CD4+Th 細(xì)胞亞群［5］。Tfh 細(xì)胞的產(chǎn)生和功能表達(dá)受多種因素調(diào)控。Bcl-6 等被認(rèn)為是Tfh 細(xì)胞產(chǎn)生和分化的關(guān)鍵分子，IL-4、IL-21等細(xì)胞因子是Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞狀態(tài)和功能的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究通過建立免疫性不育小鼠模型，分析免疫性不育小鼠與健康對照小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中濾泡輔助性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子變化，探討濾泡輔助性T細(xì)胞在免疫性不育發(fā)病過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級BALB/c小鼠，雄性，35只，6~8 周齡，體重16~18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。對BALB/c 小鼠晝夜12 h 交替光照，自由食水，于室溫（23±1）℃條件下飼養(yǎng)。

1.1.2 儀器與試劑 IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 ELISA試劑盒（美國BioLegend公司）；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；APC 標(biāo)記抗小鼠CD4 單克隆抗體、PerCP/Cy5.5 標(biāo)記抗小鼠CXCR5 單克隆抗體、FITC 標(biāo)記抗小鼠ICOS 單克隆抗體（美國eBioscience 公司）；小鼠抗精子抗體檢測試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；iMark 酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；ABI 7500 PCR 儀（美國ABI 公司）；FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞計數(shù)儀（美國BD公司）。qPCR 特異引物由Primer5 軟件設(shè)計（表1），上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21基因引物序列Tab.1 Primer sequences of Bcl-6，IL-4，IL-12，IL-17，IL-21

1.2 方法

1.2.1 免疫性不育小鼠模型的建立 每次免疫前取雄性BALB/c小鼠5只，共3次，CO2安樂死后取雙側(cè)睪丸組織，用生理鹽水沖洗，置于M199 獲能液中，剪碎，37℃ 靜置15 min，尼龍網(wǎng)（孔徑200μm）過濾，37℃ 培育 1.5 h，調(diào)整精子數(shù)為 2.0×106個/ml，加入完全弗氏佐劑，研磨混勻作為抗原。

取雄性BALB/c 小鼠20 只，隨機(jī)分為正常組和實驗組（10 只/組）。實驗組雙側(cè)腹股溝頸背部脊柱兩側(cè)皮下多點(diǎn)注射0.5 ml 抗原作為首次免疫，10 d后于上述相同部位加強(qiáng)免疫。正常組注射生理鹽水。分別于初免前及每次加強(qiáng)免疫后眼眶靜脈采血，分離血清，ELISA 檢測血清抗精子抗體（anti-sperm antibody，AsAb）。第 3 次加強(qiáng)免疫后檢測小鼠血清AsAb 水平，篩選AsAb 陽性的小鼠進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離 小鼠經(jīng)CO2安樂死后，用75%的乙醇浸泡2~3 min，減少毛發(fā)造成的污染。將小鼠移入超凈工作臺，在無菌條件下，以仰臥位固定于解剖盤。采用眼科鑷子夾起腹股溝中線處皮膚，眼科剪做一橫切口。鑷子捏住切口兩端皮膚，向小鼠的尾部和頭部縱向撕開皮膚，暴露腹腔膜壁，乙醇消毒。切開腹腔壁膜，采用鑷子夾住脾臟，剪刀剪去與其相連的組織。將分離得到的脾臟組織浸泡于干凈的PBS 溶液；在培養(yǎng)皿中加入適量PBS溶液，放置細(xì)胞篩，將脾臟取出置于細(xì)胞篩。取干凈的注射器，用其按壓處末端碾壓組織。膜內(nèi)細(xì)胞會慢慢游離出來，經(jīng)過細(xì)胞篩后，懸浮于培養(yǎng)皿溶液。洗滌細(xì)胞篩，收集細(xì)胞篩外PBS 至50 ml 離心管，400 g 離心 15 min，去上清；加紅細(xì)胞裂解液 2 ml，重懸，37℃ 靜置 2 min 后，400 g 離心15 min，加入 5 ml PBS 洗滌，400 g 離心，去上清；加入5 ml PBS重懸，除去其中不可溶的組織纖維，懸浮液取10 μl細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)Tfh 細(xì)胞的比例［6］取1×106個上述方法分離獲得的脾淋巴細(xì)胞，PBS 洗滌 2 次，4℃、1 000 r/min 離心 5 min。取100μl PBS 重懸細(xì)胞，分別加入APC 標(biāo)記抗小鼠CD4 單克隆抗體、PerCP/Cy5.5 標(biāo)記抗小鼠CXCR5單克隆抗體、FITC 標(biāo)記抗小鼠ICOS 單克隆抗體各5 μl，混勻后4℃ 避光孵育30 min。4℃、1 000 r/min離心 5 min，棄上清，PBS 洗滌后重懸細(xì)胞，PBS 稀釋至300~500μl，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 qRT-PCR 檢測免疫性不育小鼠脾淋巴細(xì)胞中 Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 水平 按照 Trizol試劑盒說明書提取脾淋巴細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行去除基因組 DNA 及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 和內(nèi)參基因GAPDH 的核酸序列通過基因庫（Gene Bank）獲得。反應(yīng)體系采用SYBR Green 熒光染料法，避光操作，每個反應(yīng)重復(fù)3 孔，在ABI 7500 PCR 儀上對轉(zhuǎn)錄因子和不同細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃34 s，共進(jìn)行個循環(huán)。

1.2.5 ELISA 檢測小鼠血清中 IL-4、IL-12、IL-17、IL-21水平 小鼠眼眶靜脈采血，離心收集血清。待測樣品孔中每孔分別加入待測血清100μl，所有樣品均作復(fù)孔，反應(yīng)板于37℃下孵育120 min。用300 μl 1×Wash Buffer 洗板 4~6 次，每個測試孔中分別加入IL-4、IL-12、IL-17、IL-21一抗工作液各50 μl，將反應(yīng)板充分混勻后于37℃孵育60 min。洗板后，各測試孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μl，反應(yīng)板于37℃孵育60 min。孵育結(jié)束后洗板，之后每孔加入底物液100 μl，置暗處反應(yīng)5~10 min。每孔加入50 μl 終止液混勻。酶標(biāo)儀檢測450 nm 處每個孔的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫性不育小鼠模型的建立 對第3 次加強(qiáng)免疫后的小鼠血清進(jìn)行AsAb 檢測，結(jié)果顯示，實驗組小鼠血清吸光度值為0.45±0.04，對照組小鼠血清吸光度值為0.18±0.01。實驗組10 只小鼠AsAb吸光度/正常對照組≥2.1，即為AsAb（+）。

2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CXCR5+ICOS+T 細(xì)胞表達(dá)水平 將分離的脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行多色免疫熒光標(biāo)記，以CD4+CXCR5+ICOS+作為Tfh 的標(biāo)志進(jìn)行分析。免疫性不育小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CXCR5+ICOS+T 細(xì)胞比例明顯高于正常對照組（P<0.001，圖1）。

圖1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CXCR5+ICOS+T 細(xì)胞的比例分析Fig.1 Analysis of proportion of CD4+CXCR5+ICOS+T cells in spleen lymphocytes of mice

2.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中 Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 mRNA 相對表達(dá)量 與對照組相比，免疫性不育小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-21 mRNA 含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），IL-17 mRNA 含量變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見圖2。

圖2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Bcl-6、IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 mRNA相對表達(dá)量Fig.2 mRNA relative expression levels of Bcl-6，IL-4，IL-12，IL-17，IL-21 in spleen lymphocytes of mice

2.4 小鼠血清中IL-4、IL-12、IL-17、IL-21 水平 與對照組相比，免疫性不育小鼠血清中IL-4、IL-12、IL-21 的含量升高（P<0.05），IL-17 含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

圖3 小鼠血清中IL-4、IL-12、IL-17、IL-21水平Fig.3 Serum levels of IL-4，IL-12，IL-17，IL-21 in mice

3 討論

前期研究認(rèn)為Th1/Th2 細(xì)胞亞群的失衡和免疫性不育的發(fā)生有關(guān)［7］。在免疫系統(tǒng)中，初始CD4+T 淋巴細(xì)胞（Th0）在局部微環(huán)境中受不同細(xì)胞因子調(diào)控向不同方向分化，其分化方向決定免疫應(yīng)答的類型。IL-21 和 IFN-γ 等可誘導(dǎo) Th0 向 Th1 分化，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-4 等可誘導(dǎo)Th0 向Th2 分化，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。TGF-β 和IL-2可誘導(dǎo)Th0 向Treg 分化，主要發(fā)揮免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用。TGF-β 和 IL-6（小鼠）或 IL-1β 和 IL-6（人）等可誘導(dǎo)Th0 向Th17 分化，主要通過分泌IL-17 刺激多種細(xì)胞參與機(jī)體的免疫防御，在固有免疫中發(fā)揮重要作用。由于Th2細(xì)胞分泌的IL-4等細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)B 細(xì)胞活化、增殖及抗體產(chǎn)生，因此Th2 細(xì)胞一直被認(rèn)為是輔助B 細(xì)胞的主要輔助性T細(xì)胞，但實驗發(fā)現(xiàn)IL-4 基因敲除小鼠并不影響抗體的產(chǎn)生［8］。Tfh 細(xì)胞由 IL-21 等誘導(dǎo) Th0 分化產(chǎn)生，是真正意義上輔助B 細(xì)胞的一群新的CD4+Th 細(xì)胞亞群。Tfh 細(xì)胞輔助B 細(xì)胞在生發(fā)中心存活、增殖，促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化、抗體類別轉(zhuǎn)換，在自身免疫性疾病中扮演重要角色［9］。

Tfh 細(xì)胞的產(chǎn)生和功能表達(dá)受多種因素調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子B 細(xì)胞淋巴瘤6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）是Tfh 細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，是區(qū)別于Th1、Th2、Th17 等輔助性T細(xì)胞的特征之一，在Tfh 的分化、特異性表面分子的表達(dá)及T細(xì)胞依賴的生發(fā)中心免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用［10］。研究顯示，Bcl-6 缺陷的小鼠體內(nèi)不能形成生發(fā)中心，Tfh 細(xì)胞發(fā)育障礙，且不能對胸腺依賴的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答［11］。本研究采用RT-PCR 方法檢測免疫性不育小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Bcl-6 的mRNA 水平，結(jié)果顯示，在免疫性不育小鼠中，Bcl-6 的表達(dá)顯著高于健康對照小鼠。流式檢測結(jié)果顯示，免疫性不育小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CXCR5+ICOS+Tfh 細(xì)胞比例明顯高于正常對照組。實驗結(jié)果提示免疫性不育小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Bcl-6 的升高可誘導(dǎo)初始T 細(xì)胞向Tfh 分化，從而增加免疫性不育小鼠中Tfh 的數(shù)量。

免疫微環(huán)境中的相關(guān)細(xì)胞因子，如IL-12、IL-21等可促進(jìn)初始 CD4+T 細(xì)胞分化為 Tfh 細(xì)胞［12-13］。IL-21 是Tfh 細(xì)胞的重要功能性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的輔助誘導(dǎo)功能，IL-21 可通過與B 細(xì)胞表面受體結(jié)合促進(jìn)B 細(xì)胞高頻突變、Ig 類別轉(zhuǎn)化及漿細(xì)胞形成［14-15］。IL-21受體（IL-21 receptor，IL-21R）表達(dá)在B細(xì)胞、T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞表面，其中B 細(xì)胞是其作用的最主要的靶細(xì)胞。通過自分泌的方式，IL-21 能促進(jìn)Tfh 自身的分化，同時影響Tfh 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的表達(dá)［16］。高表達(dá)IL-21 的小鼠漿細(xì)胞數(shù)目顯著上升，而在IL-21 缺失或IL-21R 缺陷的小鼠中，T細(xì)胞依賴型抗體的分泌發(fā)生障礙，提示IL-21 為B細(xì)胞分化及類別轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞因子，在B 細(xì)胞對T 細(xì)胞依賴抗原的免疫應(yīng)答及體液免疫的長期維持中發(fā)揮重要作用［17］。在本研究中，免疫性不育小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中IL-4、IL-12、IL-21 mRNA 的表達(dá)顯著升高，兩組間IL-17 的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA 法檢測血清中 IL-4、IL-12、IL-21、IL-17 的水平，得到了同樣的結(jié)果。推測在免疫性不育的發(fā)生過程中，大量炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞被活化，產(chǎn)生大量 IL-4、IL-12 及 IL-21，導(dǎo)致免疫微環(huán)境紊亂，使CD4+Th 細(xì)胞向Tfh 細(xì)胞分化、增殖。本研究闡明了Tfh 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在免疫性不育小鼠發(fā)病中的表達(dá)特征及意義，為后續(xù)Tfh 細(xì)胞在輔助免疫性不育機(jī)體B細(xì)胞分泌自身抗體過程中具體作用及機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。