CD30L 基因表達對脂多糖刺激后小鼠腹腔CD11b+細胞表型變化影響的研究①

張芷寧 王 笑 王曉楠 張曉清 孫 遜 （中國醫科大學免疫學教研室，沈陽110000）

CD30 和 CD30 配 體（CD30 ligand，CD30L，CD153），分別屬于腫瘤壞死因子超家族受體8（tu?mor necrosis factor receptor superfamily 8，TNFRSF8）和腫瘤壞死因子超家族8（tumor necrosis factor su?perfamily 8，TNFSF8）成員［1］。CD30 是Ⅰ型膜相關糖蛋白，最初發現于霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lym?phoma，HL）和鏡影細胞（Reed-Sternberg 細胞，R-S細胞），作為HL 中霍奇金氏細胞和R-S 細胞的標志物，主要表達在活化的效應性或記憶性T細胞，活化的 B 細胞和淋巴源性腫瘤細胞表面［2-3］。CD30L 是Ⅱ型膜相關糖蛋白，表達在巨噬細胞、樹突狀細胞、活化的 CD4+T 細胞、活化的 CD8+T 細胞、γδT 細胞、CD4+CD3?CD11c?輔助細胞表面［4-5］。CD30 和 CD30L在血液系統惡性腫瘤以及慢性炎性疾病，例如紅斑狼瘡、哮喘、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）和特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）中表達上調［6］。CD30L/CD30 在免疫系統的各個方面均具有重要的調節功能，在人T 細胞白血病中，CD30 呈現高表達并活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促進腫瘤進展［7］；在RA中CD30L/CD30發揮動態調節作用，驅動著復雜的促炎和抗炎機制［8］；在過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）中，CD30L 通過放大Th2 細胞應答效應，在過敏性鼻炎的發展中發揮重要作用［9］。故CD30L/CD30 可能在炎性疾病治療中起到關鍵性作用。然而其影響炎性疾病的機制是否與固有免疫系統有關尚未明確。

高等脊椎動物的免疫系統，主要由固有免疫系統和適應性免疫系統構成，當機體受到損傷時，自身保護性免疫機制激活，出現炎癥反應。巨噬細胞屬于固有免疫系統的細胞，小鼠體內巨噬細胞的典型標志分子包括CD11b、F4/80 等，當出現環境刺激（如微生物產物、受損細胞）時，血液循環的單核細胞在趨化因子CCL2 的作用下，進入組織并且分化成巨噬細胞，位于炎癥的浸潤部位，可以吞噬有害微生物，清除凋亡細胞并促進創傷后的組織修復［10-11］。成熟的巨噬細胞可以進一步極化為經典活化型或替代活化型巨噬細胞［12］。LPS 是革蘭氏陰性細菌外膜中的大分子，作為病原體相關模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），可以與巨噬細胞表面Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結合，活化巨噬細胞，使其抗原提呈和吞噬微生物的能力提高，并且促進促炎性細胞因子及毒性介質的分泌［13］。

本研究通過建立TGM 誘導的小鼠腹腔無菌炎癥模型，分離腹腔CD11b+細胞，利用LPS 刺激，研究在炎癥條件下CD30L 對CD11b+細胞表型變化的影響。結果顯示，Cd30l基因的缺失使小鼠腹腔CD11b+細胞的活化性表型表達下降，抑制性表型表達上升，因此CD30L 可能對CD11b+細胞表型的變化產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和材料 RPMI1640 培養基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自Biological Indus?tries 公司；脂多糖（LPS）、巰基乙酸培養基、紅細胞裂解液購自Sigma 公司；流式抗體APCCy7 antimouse CD11b、FITC anti-mouse F4/80、BV605 antimouse CD86、PE anti-mouse CD30L、V500 anti-mouse I-A/E、CD16/32 購自 Biolegend 公司。

1.1.2 實驗動物 8 周齡的SPF 級C57BL/6 雌性小鼠購自北京維通利華公司，小鼠飼養于SPF 屏障設施內。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔無菌炎癥模型的建立 小鼠腹腔注射無菌PBS 和TGM，高壓蒸汽滅菌鍋高壓滅菌PBS及TGM 121℃，15 min。使用5 ml注射器連續向小鼠腹腔注射無菌PBS或TGM 3 d，1 ml/（只·d）。

1.2.2 小鼠腹腔CD11b+細胞的分離培養 將小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下灌洗并收集腹腔細胞，常規裂解紅細胞，接種于含有10% FBS 的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養2 h，去除未貼壁細胞。

1.2.3 流式細胞術檢測注射TGM 前后WT 小鼠腹腔CD11b+細胞表型變化 制備單細胞懸液，調整濃度至1×106個/ml，100 μl抗體體系重懸細胞，按試劑盒說明書加入anti-CD16/32，避光冰上孵育15 min，加入F4/80、CD11b、CD86、CD30L、I-A/E 抗體，避光冰上孵育30 min。流式緩沖液洗滌細胞懸液，300μl流式緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.2.4 體外LPS 刺激小鼠腹腔CD11b+細胞 調整細胞濃度為5×105個/ml 并分別接種于含有10%FBS 及 10、100、1 000 ng/ml LPS 的 RPMI1640 培養基中，分別培養8 h、16 h、24 h后收集細胞。

1.2.5 流式細胞術檢測LPS 刺激WT 小鼠CD11b+細胞不同時間及濃度其表型的變化 制備單細胞懸液，調整濃度至1×106個/ml，100 μl抗體體系重懸細胞，按試劑盒說明書加入CD16/32，避光冰上孵育15 min，加入F4/80、CD11b、CD86、CD30L、I-A/E抗體，避光冰上孵育30 min。流式緩沖液洗滌細胞懸液，300μl流式緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.2.6 流式細胞術檢測LPS 刺激WT 和CD30LKO小鼠腹腔CD11b+細胞不同時間其表型變化 制備單細胞懸液，調整濃度至1×106個/ml，100 μl PBS重懸細胞，按試劑盒說明書加入CD16/32，避光冰上孵 育 15 min，加 入 F4/80、CD11b、CD86、I-A/E、CD206 抗體，避光冰上孵育30 min。流式緩沖液洗滌細胞懸液，300 μl 流式緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 7.0 軟件，在滿足方差齊性的條件下，兩組間采用獨立樣本t檢驗（Student'sttest）進行比較，計量數據以表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 注射TGM 前后，WT小鼠腹腔巨噬細胞數量及表型變化 提取小鼠腹腔CD11b+細胞，流式細胞術檢測PBS 注射組（對照組）和TGM 注射組CD11b+細胞數量變化及其表面 F4/80、CD86、I-A/E、CD30L表達情況。結果如圖1所示，與對照組相比，TGM注射組細胞總數明顯增高，CD11b+細胞數量增多。CD11b+細胞中CD86、F4/80表達無明顯變化，I-A/E、CD30L 表達下降。結果表明，向小鼠腹腔注射TGM可募集大量CD11b+細胞，且抑制CD11b+細胞上I-A/E及CD30L表達。

圖1 向小鼠腹腔注射TGM 前后，CD11b+細胞數量及表型的變化Fig.1 Changes in number of CD11b+cells in mice after in?traperitoneal injection of TGM

2.2 不同條件下LPS 刺激小鼠腹腔CD11b+細胞表型變化結果分析 使用10、100、1 000 ng/ml LPS 分別刺激培養TGM 處理的WT 小鼠腹腔CD11b+細胞8 h、16 h、24 h，并用流式細胞術檢測表型分子表達情況。結果如圖2 所示，隨著LPS 刺激CD11b+細胞時間的增加，CD11b+細胞數量逐漸增加，CD11b+細胞表面活化表型F4/80、CD86、I-A/E 表達逐漸增高，尤其在100 ng/ml 條件下上升最為明顯。使用流式細胞術檢測不同時間點CD11b+細胞上CD30L的表達，結果顯示，與對照組（0 h）相比，LPS 刺激組CD30L的表達隨著刺激時間的增加而增高。

圖2 不同條件的LPS刺激下，CD11b+細胞表面分子的表達變化Fig.2 Changes in expression of CD11b+cells surface mole?cules under different LPS conditions

2.3Cd30l基因缺失對LPS 刺激小鼠腹腔CD11b+細胞表型變化的影響 加入濃度為100 ng/ml 的LPS 刺激小鼠腹腔 CD11b+細胞 8 h、16 h 以及 24 h，并通過流式細胞術檢測細胞表型的變化。流式結果表明，隨著刺激時間的增加，與WT 小鼠相比，Cd30l基因敲除組小鼠CD11b+細胞百分比上升，CD11b+細胞中 CD86、I-A/E 表達逐漸降低，CD206表達逐漸增高（如圖3）。

圖3 CD30L對CD11b+細胞上活化與抑制表型的影響Fig.3 Effects of CD30L molecules on expression of acti?vated and inhibited phenotypes in CD11b+cells

3 討論

小鼠腹腔巨噬細胞是目前為止研究最深入的組織巨噬細胞群之一，它在清除凋亡細胞和調節炎癥反應中扮演重要角色［14-16］。在炎癥及腫瘤發生發展過程中，CD30 與其配體CD30L 結合后可進一步激活下游的轉錄因子，從而介導細胞增殖或凋亡。而LPS可激活巨噬細胞，引起細胞因子合成和釋放，進而導致炎癥的發生。CD11b 是白細胞黏附因子β 2 整合素的α 亞單位，它作為整合素家族成員之一，是巨噬細胞表面的經典標志物。表皮生長因子樣激素受體 1（EMR1），又稱 F4/80，作為 EGF TM7 蛋白家族的一員，它是小鼠巨噬細胞成熟的標志物［17］。有學者指出，腹腔巨噬細胞表達出不同水平的F4/80，主要是因為它們分化和激活的狀態不同［18］。抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）包括巨噬細胞、B 淋巴細胞、樹突狀細胞等［19］。主要組織相容性Ⅱ類分子（MHC Ⅱ）主要表達于APCs，參與T 細胞的激活和分化，調控適應性免疫應答。CD86 可以與 T 細胞表面 CD28 結合，作為 T 細胞活化 的 第 二 信 號［20］。 甘 露 糖 受 體 Mrc1，也 稱 為CD206，它表達在大多數巨噬細胞和樹突細胞亞群的表面，是M2 表型小鼠巨噬細胞的標志物，參與抗原呈遞、內吞和吞噬、信號轉導、固有免疫及適應性免疫應答反應［21-22］。

有研究將基因敲除小鼠用于鑒定參與巨噬細胞分化過程中的轉錄因子，指出PU. 1和C/ EBPα是巨噬細胞前體生成所必需的分子［23］。而本研究利用CD30L 基因敲除小鼠對LPS 刺激CD11b+細胞過程中的變化進行了研究。本研究向小鼠腹腔注射TGM 后，募集到大量CD11b+細胞，成功建立無菌炎癥模型。隨后，本課題組分離培養了原代CD11b+細胞，證明CD30L 表達在CD11b+細胞上，并且發現在LPS誘導激活后，巨噬細胞表面F4/80表達上調，提示CD11b+細胞吞噬能力增強；其表面CD30L 表達上調，提示CD30L 參與了LPS 刺激巨噬細胞活化的過程，并且可能對其活化產生了作用。隨后，本研究進行了濃度梯度實驗觀察在LPS 刺激下CD11b+細胞表面表型的變化，發現其在100 ng/ml 時的變化最為明顯。進而選擇100 ng/ml 作為刺激條件，利用Cd30l基因敲除小鼠進一步展開研究。結果發現，Cd30l基因敲除后，在LPS體外刺激條件下，巨噬細胞表面抑炎性表型CD206 表達增加，促炎性表型CD86、I-A/E 表達降低，提示其在LPS刺激下可能向著抑炎性表型活化，因此，推測CD30L 可能參與調控小鼠腹腔巨噬細胞的活化。

以往有學者對CD30L/CD30信號通路進行了研究。在OVA 誘導的過敏性鼻炎模型中，CD30L 起到抑炎作用［9］；在小鼠腦膠質瘤模型中，在腫瘤條件下，與WT 小鼠相比，CD30LKO 組小鼠腫瘤相關巨噬細胞比例明顯增高，CD206 表達增高，I-A/E 表達下降［24］，與本研究結果一致。

綜上所述，Cd30l基因的缺失能促進小鼠腹腔CD11b+細胞抑制性表型CD206 的表達上調，抑制活化性表型CD86 的表達，而在炎癥條件下這種影響的具體信號通路還有待進一步研究。