PI3K 抑制劑聯合地塞米松改善氧化應激細胞模型對激素的敏感性及其分子機制①

曾瑜真 杜開鋒 金建軍 閔智慧 毛若琳 陳智鴻

（復旦大學附屬中山醫院呼吸與危重癥醫學科，上海200032）

糖皮質激素（glucocorticoids，GC）是治療哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）等慢性氣道炎癥最常用的藥物，尤其在控制輕中度哮喘中效果最佳，然而重癥哮喘、吸煙哮喘患者以及部分COPD 患者對激素治療效果卻不理想［1-2］。盡管重癥哮喘占比較少，但其對GC 敏感性降低，由此導致的病死率較高，據報道每年因哮喘死亡的人數高達 25 萬［3-4］。在 COPD 管理中，越來越多的研究提示目前推薦的高劑量ICS 獲益不足［5］。因此，針對慢性氣道炎癥疾病開發更為有效的治療方案，對于減輕患者和社會經濟負擔尤為重要。

氧化應激是哮喘、COPD 等慢性氣道炎癥的主要發病機制之一，它可使組蛋白去乙酰化酶（his?tone deacetylase，HDAC）-2 活力降低、轉錄因子過表達和促炎信號通路增加等，這些可能導致激素不敏感［5-6］。氧化應激同時激活 PI3Kδ/Akt 信號通路，PI3Kδ 作為潛在的抗炎靶點可引起中性粒細胞活化，與哮喘和COPD對激素不敏感密切相關［7-8］。IL-8在中性粒細胞趨化過程中起關鍵作用，是COPD、哮喘等慢性氣道炎癥的促炎標志物，同時也可能是預測疾病嚴重程度的標志［9-10］。研究發現COPD 患者支氣管上皮IL-8 表達的基線水平較高，可誘導黏蛋白基因表達導致氣道黏液高分泌［11］。重癥哮喘患者誘導痰上清中IL-8 濃度高于輕度哮喘患者，預示其炎癥控制較差，預后不佳［3］。

本研究通過H2O2刺激人巨噬細胞系U937 細胞建立H2O2-TNFα-U937 細胞模型，模擬重癥哮喘、吸煙哮喘患者外周血單個核細胞（PBMCs）的氧化應激-激素耐受效應。基于 IL-8 需在 TNF-α、LPS 等誘導劑作用下合成釋放，本研究選取TNF-α 作為炎癥誘導劑，單用PI3K抑制劑或PI3K抑制劑聯合Dex干預細胞模型，探討PI3K通路在慢性氣道炎癥中的作用機制，為臨床治療慢性氣道炎癥開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人巨噬細胞系U937由中科院上海細胞生物學研究所提供。

1.1.2 主要試劑 Dex、TNF-α、H2O2購自美國Sigma公司；PI3K 抑制劑 BZE235、LY294002 購自 Selleck公司；IL-8 ELISA 試劑盒購自 R&D 公司；NF-κB、Jun、FOS 磷酸化抗體購自 CST 公司；TRIzol 購自Invitrogen 公司；熒光定量PCR 試劑盒及逆轉錄試劑盒購自 TaKaRa 公司；HDAC2 Assay Kit 購自 Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組方案 ①H2O2-TNFα-U937細胞模型建立：U937 細胞分為未處理組與H2O2（400 μmol/L）刺激組，培養 4 h 后，分別加入0.1 μmol/L Dex 作用 45 min，各孔給予 20 ng/ml TNF-α 培養24 h，取上清，按照說明書采用ELISA 檢測IL-8 的表達。各組設3 個復孔。②運用H2O2-TNFα-U937細胞模型篩選小分子抑制劑：U937細胞經400 μmol/L H2O2刺激4 h 后，分別與0.1 μmol/L Dex、1 μmol/L BEZ235/LY294002 單獨作用45 min，各孔給予20 ng/ml TNF-α繼續培養24 h，取上清，按照說明書采用ELISA 檢測IL-8 的表達。各組設3 個復孔。③小分子抑制劑BEZ235/LY294002 聯合Dex：U937 細胞經400 μmol/L H2O2刺激4 h 后，分別與 0.1 μmol/L Dex、1 μmol/L BEZ235/1 μmol/L LY294002 聯合作用45 min，各孔給予20 ng/ml TNF-α 繼續培養24 h，取上清，提取細胞RNA，ELI?SA 及實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測各組IL-8 表達；提取細胞核蛋白和總蛋白，檢測核蛋白HDAC2活力及NF-κB、AP-1蛋白磷酸化水平。各組設3個復孔。

1.2.2 Real-time PCR 檢測各組細胞 IL-8 mRNA 表達水平 用TRIzol 法提取各組細胞RNA，按照TaKaRa 逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，按照PCR 試劑盒說明書進行操作，最后計算各組細胞IL-8 mRNA 表達水平。所需引物序列如下：IL-8：（F）5'-TTGCCAAGGAGTGCTAAAGAA-3'，（R）5'-GCCCTCTTCAAAAACTTCTCC-3'；GAPDH：（F）5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'，（R）5'-TCTACACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'。

1.2.3 HDAC2活力的檢測 用碧云天核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白，然后按照HDAC2 Assay Kit說明書進行操作。

1.2.4 Western blot 檢測各組細胞 NF-κB、AP-1 蛋白表達水平 以RIPA 裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度以保證蛋白質量相同。SDS-PAGE電泳后，65 V 恒壓電轉蛋白至 PVDF 膜，BSA 封閉，滴加Jun、FOS 磷素化一抗（1∶1 000）、NF-κB 磷酸化一抗（1∶1 000）、GAPDH 一抗（1∶1 000）4℃ 孵育過夜，TBS 緩沖液漂洗后加HRP 二抗，室溫孵育1 h 后發光系統進行檢測。采用Quantity One 軟件進行相對定量分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，所得數據結果以表示。兩組間比較采用Studentt檢驗，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差異有統計學意義。使用GraphPad Prisn7軟件作圖。

2 結果

2.1 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞的抑制作用減輕 TNF-α 可刺激 U937 細胞分泌 IL-8，H2O2+TNF-α聯合刺激，使得U937 分泌IL-8 的水平更高，為421.8 pg/ml。激素（Dex）可以抑制 TNF-α-U937 模型和H2O2-TNFα-U937模型中IL-8的分泌，但它使前者IL-8 分泌水平下降為73%，而使后者IL-8 分泌水平下降僅50%（圖1）。該結果提示H2O2是氧化應激的產物，是活性氧（reactive oxygen species，ROS）成分的一種，細胞模型中添加H2O2可明顯增加細胞釋放炎癥介質的能力，并使細胞對Dex 的抑炎作用產生抵抗（圖1）。

圖1 TNF-α 刺激 Dex 預處理的 H2O2-TNFα-U937 細胞時IL-8的表達Fig.1 Effects of TNF-α on IL-8 expression in H2O2-TNFα-U937 cell pre-incubated with Dex

2.2 單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制H2O2-TNFα-U937 細胞釋放IL-8 由上述實驗可知H2O2-TNFα-U937 細胞模型對Dex 的敏感性下降，有效模擬了重癥哮喘、吸煙哮喘患者PBMCs 的氧化應激-激素耐受效應。為了了解PI3K 抑制劑能否抑制H2O2-TNFα-U937 細胞釋放 IL-8，將 Dex、PI3K 抑制劑BEZ235 或LY294002 分別與其單獨作用，檢測各組在TNF-α 刺激后的IL-8 表達水平（圖2）。結果顯示單用 Dex 可減少 H2O2-TNFα-U937 細胞釋放 IL-8 水平約 55%，而 PI3K 抑制劑如 BEZ235 或 LY294002 單獨作用于H2O2-TNFα-U937 細胞僅僅使得IL-8 的釋放減少23%、21%。說明單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制H2O2-TNFα-U937 細胞釋放IL-8，不如單用Dex的抑制效果。

圖2 PI3K 抑制劑干預后 H2O2-TNFα-U937 細胞的 IL-8 釋放情況Fig.2 Effects of PI3K inhibitor on IL-8 releasing in H2O2-TNFα-U937 cell

2.3 PI3K 抑制劑聯合Dex 明顯改善H2O2-TNFα-U937 細胞模型對激素的不敏感性 為了進一步驗證 PI3K 抑制劑聯合 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞模型 的 作 用 ，將 Dex、PI3K 抑 制 劑 BEZ235+Dex 或LY294002+Dex 分別處理 H2O2-TNFα-U937 細胞，檢測各組IL-8 分泌情況（圖3）。組間比較顯示BEZ235 或 LY294002 聯合 Dex 對 IL-8 釋放的抑制作用，對比Dex 單用抑制55%的情況下，又有明顯降低。BEZ235+Dex 組、LY294002+Dex 組分別對 IL-8的分泌抑制為86%、65%（vs H2O2-TNF-α組）。

圖3 PI3K 抑制劑聯合 Dex 干預后 H2O2-TNFα-U937 細胞的IL-8釋放情況Fig.3 Effects of PI3K inhibitor plus Dex on IL-8 releas?ing in H2O2-TNFα-U937 cell

2.4 BEZ235聯合Dex可部分恢復H2O2-TNFα-U937細胞核蛋白HDAC2 活力 已知激素耐受與氧化應激損害了HDAC2 活力有關，為了驗證PI3K 抑制劑BEZ235 或LY294002 輔助Dex 減輕該模型激素不敏感是否與HDAC2活力改善有關，提取上述各組細胞核蛋白檢測其HDAC2 活力（圖4）。結果顯示H2O2-TNFα-U937 細胞模型組較空白對照組HDAC2 活力顯著降低（P<0.01），說明氧化應激可損害U937 細胞核蛋白HDAC2 活力，在Dex 單獨處理后能部分恢復其 HDAC2 活力，但不顯著；BEZ235 聯合 Dex 可進一步促進 HDAC2 活力恢復（vs H2O2組，P<0.05），Dex 聯合LY294002 與H2O2組相比無明顯差異。提示PI3K 的兩個抑制劑對HDAC2 活力恢復能力不同。BEZ235 聯合Dex 能更加有效地逆轉該模型核蛋白HDAC2活力，從而改善其對激素的敏感性。

圖4 Dex 或 PI3K 抑制劑聯合 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞核蛋白HDAC2活力的影響Fig.4 Effect of DEX or PI3K inhibitor combined with Dex on activity of nuclear protein HDAC2 in H2O2-TNFα-U937 cell

2.5 PI3K 抑制劑（BEZ235/LY294002）聯合Dex 可降低H2O2-TNFα-U937 細胞中炎癥轉錄因子NF-κB、AP-1 的磷酸化水平 為了探索BEZ235/LY294002聯合Dex 減輕H2O2-TNFα-U937 模型對激素不敏感的機制，通過 Western blot 檢測各組 NF-κB 磷酸化水平及AP-1 亞基c-FOS 及c-Jun 蛋白磷酸化水平（圖5）。結果表明H2O2處理使炎癥轉錄因子（NF-κB、c-FOS、c-JUN）磷酸化水平顯著高于空白對照組（P<0.01）；Dex 單獨處理后 NF-κB 磷酸化水平無明顯變化，而 LY294002 聯合 Dex 能顯著抑制 NF-κB 磷酸化水平（P<0.01）；BEZ235 或 LY294002 聯合 Dex 均能顯著抑制c-FOS 和c-JUN 磷酸化水平（P<0.01）。提示BEZ235 或LY294002 能通過減輕相應炎癥轉錄因子磷酸化水平來輔助Dex發揮抗炎作用。

圖5 PI3K 抑制劑聯合 Dex 對 H2O2-TNFα-U937 細胞炎癥轉錄因子磷酸化的影響Fig.5 Effects of PI3K inhibitor on phosphorylation of nuclear signal transcription factors in H2O2-TNFα-U937 cell

3 討論

氧化應激是哮喘、COPD 等慢性氣道炎癥性疾病的主要發病機制之一，也是激素治療不敏感的關鍵因素［2］。但激素不敏感的發生機制涉及多種途徑，目前仍沒有明確證據指明如何改善這一現象。本研究前期預實驗分離了重癥哮喘、輕中度哮喘和健康對照者的PBMCs，證實Dex 抑制重癥哮喘組PBMCs 釋放IL-8 的作用較后兩組明顯減弱（數據尚未發表）。因此，建立H2O2-TNFα-U937 細胞模型來模擬氧化應激-激素耐受效應，以求深入研究氧化應激對慢性氣道炎癥激素不敏感的作用并探討改善途徑。結果發現H2O2處理U937 細胞后，細胞釋放IL-8 明顯增多，對Dex 的抑炎作用產生了抵抗，提示H2O2引起的氧化應激的確能損害細胞對激素的敏感性。

煙霧暴露哮喘小鼠模型表明，氧化應激可激活PI3K 通路，促進炎癥反應，從而降低激素敏感性，且PI3Kδ 和γ 是潛在的抗炎靶點［12］。因此本研究選取了 BEZ235 和 LY294002 兩種 PI3K 抑制劑對 H2O2-TNFα-U937 細胞模型進行單獨干預，結果表明單用PI3K 抑制劑不能明顯抑制細胞釋放IL-8，甚至不如單用Dex。顯然單獨抑制PI3K 通路并不能有效抑制炎癥反應，這可能與抑制IL-8 基因表達還需通過GC-糖皮質激素受體（GR）復合物與IL-8基因相互作用實現有關，目前尚無證據能予以解釋。本研究進一步采用上述兩種PI3K 抑制劑聯合Dex 對細胞模型進行干預，發現兩種PI3K 抑制劑聯合Dex 能明顯改善細胞對激素的抵抗，與單用Dex 或PI3K 抑制劑相比有顯著差異。聯合Dex干預有效或許在一定程度上與本研究的假設符合，但具體原因需要更多實驗進行探索。

組蛋白去乙酰化酶（HDACs）家族是一類細胞內酶，可催化組蛋白賴氨酸去乙酰化來調節基因表達，HDAC2 幾乎僅存在于細胞核中，是關閉活化的炎癥基因的關鍵核酶，因此，HDAC2 減少將引起炎癥過程放大［13］。研究表明氧化應激能通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路導致HDAC2 活力降低，與哮喘和 COPD 患者激素不敏感性的發生密切相關［7，14］。臨床研究也發現肺內氧化應激水平高的重癥哮喘患者HDAC2活力明顯受損，而低濃度茶堿有望通過PI3Kδ 依賴機制將降低的HDAC2 活力恢復到正常水平，改善COPD、重癥哮喘和吸煙哮喘患者對激素的不敏感［15］。為了驗證小分子抑制劑輔助Dex改善細胞對激素的不敏感性是否與HDAC2 活力改變有關，本研究檢測了細胞核蛋白HDAC2 活力，結果證實氧化應激損害了U937 細胞核蛋白HDAC2 活力，Dex 單獨處理僅能部分恢復其HDAC2 活力，但并不顯著，與上述研究中Dex 對炎癥介質釋放的抑制作用明顯減弱一致；BEZ235 聯合Dex 能進一步促進HDAC2 活力恢復，LY294002 聯合 Dex 與 H2O2組相比差異無統計學意義，盡管該結果與LY294002 能改善激素抵抗的發現相矛盾，也許是由于LY294002作為非選擇性抑制劑，干預了其他通路導致其恢復HDAC2的活力受到了影響。

GC 的間接基因調控中，GR 結合HDAC2脫去乙酰基，使轉錄因子如 NF-κB 和 AP-1 失去功能，抑制炎癥基因轉錄［16］，因此本研究檢測了 BEZ235 或LY294002 聯合 Dex 對 NF-κB、AP-1 磷酸化水平的影響，研究其改善激素不敏感性的機制。通過West?ern blot 分析，發現 Dex 單獨處理后 NF-κB 磷酸化水平無明顯變化，BEZ235 或 LY294002 聯合 Dex 均能顯著抑制AP-1 磷酸化水平，但僅LY294002 聯合Dex 能顯著抑制 NF-κB 磷酸化水平，可見 BEZ235 或LY294002 聯合Dex 改善激素不敏感性的調節機制復雜，在輔助Dex 發揮抗炎作用的不同環節中存在著一定差異。LY294002 聯合Dex 雖不能恢復HDAC2 的活力，但能通過減少 NF-κB、AP-1 的磷酸化水平來輔助Dex 改善氧化應激導致的激素不敏感，這也說明激素不敏感的具體作用機制亟待后續的深入探索。

由于本研究細胞模型并非慢性氣道炎癥疾病患者的來源細胞，氣道炎癥環境又較為復雜，故在某些程度上存在局限性。但從一定意義上來說，它是模擬重癥哮喘、吸煙哮喘患者PBMCs 對激素干預不敏感效應的體外細胞工具。通過該細胞模型，本研究證實PI3K 抑制劑聯合Dex 可以通過恢復HDAC2活力和（或）抑制核信號轉錄因子磷酸化，在體外改善H2O2-TNFα-U937 細胞模型對激素的不敏感性。PI3K 抑制劑是否能輔助激素治療因氧化應激導致的慢性氣道炎癥患者對激素的不敏感性還有待深入研究。