DUSP6沉默對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞凋亡和遷移的影響及機制研究①

薛艷軍 林麗紅 高雁榮 馬 媛 劉弘揚（安陽市腫瘤醫(yī)院婦二科，安陽455000）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是婦科生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌。目前臨床主要通過手術(shù)切術(shù)和藥物化療等方式治療EC，但其復發(fā)率較高、預后較差，總體生存率不高，嚴重威脅女性生命健康。隨著對EC分子機制研究的深入，多種分子靶向藥物在臨床得到廣泛應用，并且已顯示出良好療效，通過研究腫瘤細胞轉(zhuǎn)移機制，對分子靶向治療EC，提高患者生存率具有重要意義［1］。雙特異性磷酸酶家族（dual specificity phosphatase，DUSPs）屬于蛋白酪氨酸磷酸酶成員，可同時去磷酸化酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸殘基，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等多種疾病形成中發(fā)揮重要作用［2］。DUSP6在不同腫瘤中的表達水平存在差異，可以作為抑癌基因抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，也可作為原癌基因促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移［3-4］。既往研究顯示，DUSP6表達異常與甲狀腺癌、肺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-6］。但DUSP6在EC中的作用研究尚少，本研究旨在研究DUSP6對Ishikawa細胞凋亡及遷移的作用，并探討其可能作用機制，為臨床治療EC提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 試劑和儀器 含有過表達DUSP6（DUSP6）、過表達陰性對照（DUSP6-NC）、沉默DUSP6（si-DUSP6）、沉默陰性對照（siDUSP6-NC）序列的pSIHIH1-COPGFP質(zhì)粒（上海吉瑪公司）；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（美國Gibco公司）；兔抗大鼠細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）多克隆抗體、p-ERK1/2多克隆抗體（美國CST公司）；山羊抗兔IgG-HRP（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；FACSCalibu流式細胞儀系統(tǒng)（美國BD公司）；ELX800全自動酶標儀（美國biotek公司）；DYCP-31DN電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取Ishikawa細胞，接種于RPMI 1640培養(yǎng)基（含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素）中，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，實驗選取對數(shù)期細胞。

1.2.2 藥物處理及分組 轉(zhuǎn)染前1 d，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，接種于6孔板，待細胞密度達80%時進行轉(zhuǎn)染。分別將5μl LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和5μl含有DUSP6、DUSP6-NC、siDUSP6、si-DUSP6-NC序列的質(zhì)粒加入到250μl培養(yǎng)基中，混合均勻后，靜置5 min，然后將2種液體混合均勻，制成質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物，靜置20 min后進行轉(zhuǎn)染。將細胞隨機分為空白對照組（轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000）、過表達組（轉(zhuǎn)染DUSP6質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物）、過表達NC組（轉(zhuǎn)染DUSP6-NC質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物）、沉默組（轉(zhuǎn)染siDUSP6質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物）、沉默NC組（轉(zhuǎn)染siDUSP6-NC質(zhì)粒脂質(zhì)體復合物）。于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，48 h后顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率（%）=綠色熒光細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中DUSP6 mRNA水平各組細胞采用TRIzol法提取細胞中總RNA，酶標儀測定RNA濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄模板進行PCR擴增。反應體系包括：模板cDNA 2μl，上下游引物各0.5μl，Taq DNA聚合酶10μl，雙蒸水7μl。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸60 s，共45個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計算DUSP6相對表達水平。引物序列：DUSP6正向：5'-CGATCGATGCTAGCTAGCTAAC-3'；反向：5'-ACGATGCATGCATGCTAGCA-3'；β-actin正向：5'-AGCTAGCTAGCTAGCGCTA-3'；反 向：5'-TGCATAGCTAGCTAGCTAT-3'。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖情況 各組細胞用0.25%胰酶消化后，用培養(yǎng)基進行重懸，調(diào)整細胞密度為3.0×104個/ml，接種于96孔板，每組設(shè)置5個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每個時間點結(jié)束前4 h棄去培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)基，每孔加入20μl MTT溶液（0.5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，充分振蕩10 min以溶解結(jié)晶，在酶標儀上490 nm處測定光密度（A）值。以A值表示細胞增殖能力。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取48 h后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細胞，胰酶消化后收集細胞，2 000 r/min（離心半徑8 cm）室溫離心5 min，棄上清，4℃PBS洗滌，加入200μl Binding buffer重懸細胞，加入5μl AnnexinV-FITC，4℃混勻，加入10μl PI染液，室溫避光染色10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取48 h后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細胞，按1×105個/孔濃度接種于6孔板，待細胞生長鋪滿板底時，使用200μl無菌移液槍頭在培養(yǎng)板底部劃一條直線，用PBS洗去周圍劃下的細胞，顯微鏡下觀察0 h劃痕距離并進行拍照，培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察各組細胞劃痕愈合程度并拍照，計算愈合率。愈合率（%）=（0 h劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.7 Western blot檢測細胞中DUSP6、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平 收集48 h后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細胞，加入細胞裂解液后裂解細胞，12 000 r/min離心5 min，取上清，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，取50μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，TBST溶液洗膜，4℃孵育DUSP6（1∶1 000）、

ERK1/2（1∶2 000）、p-ERK1/2（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000）抗體，TBST溶液洗膜，室溫孵育相應二抗，TBST溶液洗膜，加入ECL發(fā)光液，孵育，顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。目的蛋白相對表達水平以其與內(nèi)參β-actin灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染48 h后，顯微鏡觀察各組細胞轉(zhuǎn)染效率均≥85%，可用于后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 細胞轉(zhuǎn)染效率（×400）Fig.1 Cell transfection efficiency（×400）

2.2 DUSP6 mRNA相對表達水平比較 空白對照組、過表達NC組、過表達組、沉默NC組和沉默組DUSP6 mRNA相 對表達 量分別 為：1.03±0.26、1.01±0.31、5.26±0.43、1.05±0.28、0.21±0.15。DUSP6 mRNA相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=225.813，P＜0.05）。與空白對照組和過表達NC組比較，過表達組DUSP6 mRNA相對表達量升高（P＜0.05）；與空白對照組和沉默NC組比較，沉默組DUSP6 mRNA相對表達量降低（P＜0.05）；過表達組DUSP6 mRNA相對表達量高于沉默組（P＜0.05）。空白對照組、過表達NC組和沉默NC組DUSP6 mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 細胞增殖水平比較 各組細胞MTT法24、48、72 h增殖能力比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和過表達NC組比較，過表達組細胞MMT法24、48、72 h增殖能力減小（P＜0.05）；與空白對照組和沉默NC組比較，沉默組細胞MMT法24、48、72 h增殖能力增加（P＜0.05）；過表達組MMT法24、48、72 h增殖能力小于沉默組（P＜0.05）；空白對照組、過表達NC組和沉默NC組MT法24、48、72 h增殖能力比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組細胞不同時間增殖水平比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of cell proliferation levels in different groups of cells（±s，n=5）

表1 各組細胞不同時間增殖水平比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of cell proliferation levels in different groups of cells（±s，n=5）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with overexpression NC group，2）P＜0.05；compared with overexpression group，3）P＜0.05.

Groups Blank control Overexpression NC Overexpression silent NC silent F P 24 h 0.35±0.03 0.36±0.04 0.30±0.031）2）0.37±0.03 0.45±0.041）2）3）12.415＜0.001 48 h 0.47±0.05 0.46±0.04 0.39±0.041）2）0.46±0.05 0.65±0.061）2）3）19.979＜0.001 96 h 0.62±0.06 0.61±0.07 0.51±0.051）2）0.63±0.07 0.83±0.081）2）3）15.247＜0.001

2.4 細胞凋亡率比較 如圖2所示，空白對照組、過表達NC組、過表達組、沉默NC組和沉默組細胞凋 亡 率 分 別 為：（1.03±0.26）%、（1.01±0.31）%、（5.26±0.43）%、（1.05±0.28）%、（0.21±0.15）%。細胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=225.813，P＜0.05）。與空白對照組和過表達NC組比較，過表達組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與空白對照組和沉默NC組比較，沉默組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；過表達組細胞凋亡率高于沉默組（P＜0.05）。空白對照組、過表達NC組和沉默NC組細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組細胞凋亡率比較Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.5 細胞遷移能力比較 空白對照組、過表達NC組、過表達組、沉默NC組和沉默組細胞愈合率分別為：（45.26±5.48）%、（43.89±5.77）%、（21.26±5.12）%、（46.31±5.91）%、（72.45±7.16）%。細胞愈合率組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=46.827，P＜0.05）。與空白對照組和過表達NC組比較，過表達組細胞愈合率降低（P＜0.05）；與空白對照組和沉默NC組比較，沉默組細胞愈合率升高（P＜0.05）；過表達組細胞愈合率低于沉默組（P＜0.05）。空白對照組、過表達NC組和沉默NC組細胞愈合率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組細胞遷移情況（×100）Fig.3 Cell migration of each group（×100）

2.6 細胞中DUSP6、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比較 細胞中DUSP6、p-ERK1/2蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組和過表達NC組比較，過表達組DUSP6蛋白相對表達量升高，p-ERK1/2蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與空白對照組和沉默NC組比較，沉默組DUSP6蛋白相對表達量降低，p-ERK1/2蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；過表達組DUSP6蛋白相對表達量高于沉默組，p-ERK1/2蛋白相對表達量低于沉默組（P＜0.05）；空白對照組，過表達NC組和沉默NC組DUSP6、p-ERK1/2蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組細胞ERK1/2蛋白相對表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2和圖4。

表2 細胞中DUSP6、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of DUSP6，ERK1/2 and p-ERK1/2 protein levels in cells（±s，n=5）

表2 細胞中DUSP6、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of DUSP6，ERK1/2 and p-ERK1/2 protein levels in cells（±s，n=5）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with corresponding NC group，2）P＜0.05；compared with overexpression group，3）P＜0.05.

Groups Blank control Overexpression NC Overexpression silent NC silent F P DUSP6 0.31±0.05 0.32±0.09 0.42±0.041）2）0.30±0.05 0.13±0.041）2）3）134.402＜0.001 ERK1/2 1.02±0.12 1.01±0.10 0.98±0.11 1.03±0.11 0.99±0.12 0.005 1.000 p-ERK1/2 0.65±0.06 0.67±0.07 0.23±0.041）2）0.63±0.06 0.89±0.081）2）3）70.995＜0.001

圖4 細胞中DUSP6、ERK 1/2、p-ERK 1/2蛋白表達情況Fig.4 DUSP6，ERK1/2 and p-ERK1/2 protein expressions in cells

3 討論

EC是女性常見三大腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個涉及多因素、多步驟的復雜過程并涉及多基因、多通路之間相互調(diào)控。EC早期癥狀明顯，明確診斷并采取手術(shù)切除及化學輔助治療可顯著提高患者生存質(zhì)量，但化療存在藥物耐藥性，部分患者術(shù)后易復發(fā)，影響患者預后。根據(jù)疾病的分子特征，采用基因靶向治療，可改善結(jié)直腸癌及肝癌等多種腫瘤患治療效果，延長患者無進展生存期［7-8］。通過研究腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制，尋找有效的靶基因?qū)τ谂R床治療EC具有重要意義。

DUSP6具有促癌和抑癌的雙重作用，已有相關(guān)研究表明DUSP6在部分腫瘤中的表達水平及其臨床意義。JAMES等［9］研究顯示，DUSP6在漿液性卵巢癌組織中的表達水平高于鄰近正常組織，可減少腫瘤細胞化學耐藥性。在惡性周圍神經(jīng)鞘瘤中，通過靶向抑制DUSP6，可以有效抑制腫瘤細胞增殖促進細胞凋亡［10］。本研究通過RT-qPCR檢測Ishikawa細胞中DUSP6表達水平，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，轉(zhuǎn)染DUSP6后，DUSP6表達升高，同時MTT和劃痕實驗顯示細胞增殖水平和遷移能力降低，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示細胞凋亡率升高，轉(zhuǎn)染si-DUSP6后，DUSP6表達降低，細胞增殖水平和遷移能力升高，凋亡率降低，提示DUSP6表達水平與EC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究顯示，DUSP6在不同腫瘤中的作用不盡相同，肝癌細胞中DUSP6過表達可抑制細胞增殖，大腸癌小鼠中DUSP6表達缺失可促進結(jié)腸上皮細胞增殖［11-12］。本研究顯示沉默Ishikawa細胞中DUSP6表達，表現(xiàn)出對細胞凋亡的抑制作用以及對增殖及遷移的促進作用，提示沉默DUSP6表達，有助于促進EC發(fā)生發(fā)展。

ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，多種因素可將其磷酸化激活，進入細胞核促進某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達，使特定蛋白表達或活性發(fā)生改變，從而對細胞代謝和功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與細胞增殖、分化及凋亡等過程［13］。既往研究顯示，ERK1/2在胰腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中通過抑制細胞與基質(zhì)之間的相互作用，促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲［14-15］。DUSP6對ERK1/2起負性調(diào)控作用，可特異性作用于ERK1/2的TEY基序，對其蘇氨酸及酪氨酸殘基進行去磷酸化，引起ERK1/2失活，當DUSP6對ERK1/2的去磷酸化處于失衡狀態(tài)，可能導致惡性腫瘤發(fā)生。研究顯示，DUSP6可通過負向調(diào)控ERK1/2磷酸化水平，抑制傳染性支氣管炎病毒復制增殖［16］。在彌漫性大B淋巴細胞瘤中，可通過下調(diào)DUSP6表達磷酸化激活ERK1/2，提高腫瘤細胞增殖能力［17］。DUSP6作為ERK1/2重要的負調(diào)控因子，當其表達異常降低時，激活ERK1/2通路，可能導致腫瘤進一步惡化。本研究轉(zhuǎn)染DUSP6后，DUSP6表達升高，而p-ERK1/2蛋白表達降低，轉(zhuǎn)染siDUSP6后，DUSP6表達降低，p-ERK1/2蛋白表達升高，提示DUSP6表達可能參與調(diào)控ERK1/2通路，沉默DUSP6可促進ERK1/2通路磷酸化激活，從而促進細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡。

綜上所述，DUSP6沉默可促進Ishikawa細胞增殖和遷移，抑制其凋亡，可能是通過激活ERK1/2信號通路發(fā)揮促癌作用，為臨床治療EC提供靶點和理論依據(jù)。