LncRNA AC010145.4在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲的影響

郭 勇 李 波 蒲邦明 方 超 李春桃（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽外科，瀘州646000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大最常見的腫瘤，居全球腫瘤相關(guān)死亡原因的第三位［1］。HCC在原發(fā)性肝癌患者中占90%以上。其預(yù)后較差，5年生存率僅為17%～53%［2-3］。目前，HCC的根治性手術(shù)治療僅在疾病早期階段有效，但大多數(shù)患者在診斷時(shí)就已處于晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高是導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的主要因素。因此，迫切需要對(duì)HCC機(jī)制的新見解，以確定新的預(yù)后分子標(biāo)志物和潛在的有效治療靶點(diǎn)，從而提高患者的存活率［4-5］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，LncRNA）是一類長度超過200個(gè)堿基對(duì)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，表現(xiàn)出有限的蛋白質(zhì)編碼能力。許多LncRNA在分化的組織或特定的癌癥類型中特異性表達(dá)［6-7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA通過與其他細(xì)胞大分子相互作用驅(qū)動(dòng)許多重要的癌癥表型，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，異常的LncRNA表達(dá)在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［9-10］。有研究者發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4參與調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展，然而關(guān)于LncRNA AC010145.4在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義的研究卻十分有限［11］。本研究擬分析HCC癌組織中LncRNA AC010145.4的表達(dá)，并觀察其對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞活力和侵襲能力的影響，以期為HCC的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年1月于我院接受手術(shù)切除術(shù)的HCC患者131例作為研究對(duì)象，收集患者相關(guān)病例資料、愈后情況。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理證實(shí)為HCC；②術(shù)前未接受抗腫瘤治療；③接受完全腫瘤切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①院內(nèi)死亡；②合并其他惡性腫瘤者；③病例資料不全者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞來源 HCC細(xì)胞系SMMC-7721和HCCLM3均購自于美國菌種保藏中心。SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系均在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)于RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自北京友康恒業(yè)生物科技有限公司；慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；Trizol試劑盒、Prime Script RT試劑盒、SYBR premix ex TaqtmⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。Stratagene MX3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國安捷倫。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA AC010145.4相對(duì)表達(dá)量測量 分別取50 mg癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行超聲勻漿，Trizol試劑盒提取HCC癌組織和癌旁組中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR premix ex TaqtmⅡ試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA AC010145.4表達(dá)。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min；（95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s）×40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA AC010145.4的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染LncRNA AC010145.4 siRNA SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系消化和傳代時(shí)間為48 h，實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長相細(xì)胞。將SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板，并培養(yǎng)直至達(dá)60%融合。去除6孔板中的血清，Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染經(jīng)慢病毒包裝的siRNA（沉默表達(dá)組，siRNA組）和空載體（陰性對(duì)照組，Ctrl組）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)研究。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測定 將siRNA組和Ctrl組對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系接種于96孔板（3 000個(gè)/孔），分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。在添加CCK-8之前，改變培養(yǎng)基。每孔加入90μl培養(yǎng)基和10μl CCK-8。使用微孔板讀數(shù)器測定450 nm處的OD值。并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力測定 取siRNA組和Ctrl組對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞懸浮。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，并將100μl細(xì)胞懸浮液添加至Transwell室。然后將800μl培養(yǎng)基（帶有轉(zhuǎn)染復(fù)合物或NC）加入下室的24孔板。培養(yǎng)24 h后，移除Transwell室，PBS沖洗后，福爾馬林固定細(xì)胞。用棉簽擦拭微孔膜上細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下，將圖像放大200倍以計(jì)算每個(gè)區(qū)域的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢測，數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線（ROC）計(jì)算LncRNA AC010145.4對(duì)HCC患者術(shù)后生存的預(yù)測價(jià)值。采用Kaplan-Meier并Log-rank檢驗(yàn)比較LncRNA AC010145.4表達(dá)對(duì)HCC患者術(shù)后總體生存時(shí)間的影響。COX回歸模型分析影響HCC患者術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC癌組織中LncRNA AC010145.4表達(dá) 通過RT-qPCR檢測HCC患者的癌旁組織和癌組織中LncRNA AC010145.4的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，HCC癌組織中的LncRNA AC010145.4表達(dá)顯著升高（9.13±2.43 vs 1.33±0.40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 HCC患者癌組織和癌旁組織中LncRNA AC010145.4的表達(dá)差異Fig.1 Different expression of LncRNA AC010145.4 in cancer and paracancerous tissuesof HCC patients

2.2 LncRNA AC010145.4表達(dá)對(duì)HCC患者的診斷價(jià)值 如圖2所示，LncRNA AC010145.4對(duì)預(yù)測HCC患者術(shù)后死亡的最佳臨界值為5.98，靈敏度為94.2%，特異度為67.7%，AUC為0.775，95%CI：0.69～0.84（P＜0.05）。

圖2 LncRNA AC010145.4預(yù)測HCC患者術(shù)后死亡的ROC曲線Fig.2 ROC curve of LncRNA AC010145.4 to predict postoperative mortality in HCC patients

2.3 LncRNA AC010145.4表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 根據(jù)ROC曲線結(jié)果，將LncRNA AC010145.4表達(dá)水平高于5.98者定義為高表達(dá)組（n=73），將LncRNA AC010145.4表達(dá)水平低于5.98者定義為低表達(dá)組（n=58），分析LncRNAAC010145.4相對(duì)表達(dá)量與HCC患者的臨床病理特征關(guān)系，結(jié)果如表1。LncRNA AC0 10145.4表達(dá)與患者的性別、年齡、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分級(jí)、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表1 HCC患者LncRNA AC010145.4相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］Tab.1 Relationship between relative expression of LncRNA AC010145.4 and clinicopathological characteristicsin HCC patients［n（%）］

2.4 HCC患者單因素生存分析結(jié)果 如圖3、表2，單因素生存分析顯示，較高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分級(jí)B級(jí)、較大腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是經(jīng)手術(shù)治療HCC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖3 LncRNA AC010145.4相對(duì)表達(dá)量與HCC患者術(shù)后生存率相關(guān)性Fig.3 Correlation between relative expression of LncRNA AC010145.4 and postoperative survival rate of HCC patients

表2 HCC患者術(shù)后生存率單因素及多因素回歸分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analysis for HCC patients

2.5 HCC患者Cox回歸分析結(jié)果 將單因素生存分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入Cox回歸模型進(jìn)行分析得出：較高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分級(jí)B級(jí)、較大腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是經(jīng)手術(shù)治療HCC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

2.6 沉默LncRNA AC010145.4表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌增殖 由圖4可知，siRNA組細(xì)胞增殖活力較Ctrl組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明沉默LncRNA AC010145.4表達(dá)能抑制SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞的增殖能力。

圖4 Ctrl組與siRNA組的細(xì)胞增殖曲線比較Fig.4 Comparison of cell proliferation curve between Ctrl and siRNA group

2.7 沉默LncRNA AC010145.4表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌侵襲 Transwell實(shí)驗(yàn)表明，在×200的視野下，SMMC7721細(xì)胞siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為（33±6）×103個(gè)，Ctrl組侵襲細(xì)胞數(shù)為（98±23）×103個(gè)；HCCLM3細(xì)胞siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為（30±5）×103個(gè)，Ctrl組侵襲細(xì)胞數(shù)為（90±20）×103個(gè)；兩種細(xì)胞siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于Ctrl組（均P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 沉默LncRNA AC010145.4抑制HCC侵襲（×200）Fig.5 Silence of LncRNA AC010145.4 inhibit HCC invasion（×200）

3 討論

HCC是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，臨床上尚未發(fā)現(xiàn)可靠的HCC治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的主要原因。有研究者認(rèn)為，單純DNA突變并不能完全解釋HCC發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜進(jìn)程［12］。目前，基因不同水平表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究是診斷和治療HCC的熱點(diǎn)。LncRNA是一類長度超過200個(gè)堿基對(duì)但不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA。人類基因組中LncRNA的確切數(shù)目仍存在爭議，但有研究者認(rèn)為人類基因組中有超過60 000個(gè)LncRNA。最近研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA是多種生物學(xué)過程中的重要分子，包括發(fā)育、表觀遺傳學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、激素反應(yīng)、癌癥和腦功能等。

既往研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在HCC患者的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［8，13］。DING等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PVT1在肝癌組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)升高可增加肝癌復(fù)發(fā)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。LncRNA CCAT1在肝癌組織中高表達(dá)，且與臨床分期和腫瘤大小相關(guān)，是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［15］。ZHANG等［16］發(fā)現(xiàn)，LncRNA SNHG15在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，且LncRNA SNHG15表達(dá)與肝癌分級(jí)、血管侵犯、TNM分期及預(yù)后相關(guān)。劉浩等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4在直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量升高，可能是評(píng)估直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)LncRNA AC010145.4表達(dá)對(duì)HCC患者的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4在HCC癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織，提示LncRNA AC010145.4可能在HCC中高表達(dá)。進(jìn)一步研究LncRNA AC010145.4表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4表達(dá)與HCC患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分級(jí)、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，與既往研究結(jié)果類似。

既往研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CCAT1是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［15］。劉浩等［17］報(bào)道，LncRNA AC010145.4是評(píng)估直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。趙沖等［11］發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4高表達(dá)小細(xì)胞肺癌患者的總體生存時(shí)間和無進(jìn)展生存時(shí)間均短于低表達(dá)者。本研究以ROC曲線得出臨界值，證實(shí)LncRNA AC010145.4低表達(dá)組總體生存率顯著高于LncRNA AC010145.4高表達(dá)組。提示LncRNA AC010145.4可能與疾病進(jìn)展有關(guān)，是HCC患者預(yù)后的影響因素之一。

細(xì)胞惡性增殖、侵襲及遷移是腫瘤發(fā)展過程中的主要特征之一［18-19］。HUANG等［18］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CDKN2B-AS1可通過靶向let-7c-5p/NAP1L1軸促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。YAN等［20］發(fā)現(xiàn)LncRNAmiR31HG可通過靶向miR-575抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系上LncRNA AC010145.4沉默表達(dá)組OD450nm值顯著低于Ctrl組，且侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于Ctrl組，這與HCC癌組織內(nèi)的結(jié)果一致，提示LncRNA AC010145.4沉默表達(dá)可能具有抑癌作用。進(jìn)一步證實(shí)了LncRNA AC010145.4可能與HCC病理生理機(jī)制相關(guān)。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了LncRNA AC010145.4在HCC癌組織中表達(dá)升高，且與不良臨床病理特征相關(guān)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默LncRNA AC010145.4表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞系增殖和侵襲，提示LncRNA AC010145.4在HCC中可能起到促癌基因的作用。然而，影響HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制復(fù)雜，LncRNA AC010145.4調(diào)節(jié)HCC患者發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制及參與的信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。