人參皂苷Rh4調控ERK和AKT信號通路對T-ALL細胞凋亡的影響

王雪蓮 孟亞紅 孫麗華（上海復旦大學附屬中山醫院青浦分院血液科，上海201700）

T急性淋巴細胞白血病（T-acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一種侵襲性血液腫瘤，約占所有淋巴細胞白血病的20%，成人發病率顯著高于兒童［1］。PI3K/AKT及ERK通路上調是T-ALL發生發展的重要通路，抑制其上調可治療T-ALL［2-3］。人參作為傳統中草藥已被廣泛使用2 000余年，具有抗過敏、抗氧化、免疫刺激等特性，可調節血壓、代謝和免疫功能，人參皂苷Rh4是人參三醇的主要活性單體，僅結合1個糖基，具有低極性、易被腸道吸收的特點，可通過調節ROS/JNK/p53通路誘導結直腸癌細胞凋亡［4］。Rh4還可誘導白血病K562細胞分化并抑制其增殖，但對T-ALL的作用和機制尚未闡明［5］。本研究主要探討人參皂苷Rh4通過調控ERK和AKT信號通路對T-ALL細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人T-ALL細胞系Molt4（CRL-1582，美國ATCC公司）；RPMI1640培養基（C11875500BT，美國Gibco公司）；人參皂苷Rh4（PHL85741，美國Sigma公司）；PI3K抑制劑LY294002（S1105）和MEK抑制劑U0126（S1102，Selleck公司）；CCK-8試劑盒（B20185364，碧云天公司）；Annexin V-FITC/碘化丙錠（PI）試劑盒（2170822）、FACSCantoⅡ流式細胞儀（加拿大BDBiosciences公司）；Model 680酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組和處理 Molt4細胞培養于RPMI1640培養基，加入終濃度為0、10、20、40、60、80和100μmol/L的Rh4培養24、48和72 h，CCK-8法計算抑制率=（OD實驗-OD對照）/OD對照×100%。為研究Rh4通過PI3K/AKT通路對T-ALL的作用，將細胞分為對照組、Rh4組、Rh4+LY294002組和LY294002組，Rh4濃度為42.75μmol/L，LY294002濃度為50μmol/L［5-6］。為分析Rh4通過MEK/ERK通路對T-ALL的作用，將細胞分為對照組、Rh4組Rh4+U0126組和U0126組，Rh4濃度為40μmol/L，U0126濃度為50μmol/L［7］。對照組加入等體積溶劑培養48 h。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖情況 將1×105個處理后細胞（150μl）接種于96孔板，分別在第24 h、48 h和72 h加入10μl CCK-8試劑，37℃孵育顯色，酶標儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 處理后的細胞采用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，將1×106個細胞先后采用預冷PBS和5%牛血清白蛋白（BSA）洗滌3次，2 000 r/min離心，加入300μl 5%BSA和700μl 70%預冷酒精，低溫孵育過夜，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入100μl結合緩沖液和5μl Annexin-V-FITC（20μg/ml）靜置15 min，黑暗中孵化，加入150μl結合緩沖液和10μl PI（50μg/ml）靜置15 min，黑暗中孵化，流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 將細胞研磨、裂解并收集總蛋白，分別取等量總蛋白在120 V下SDS-PAGE電泳分離90 min，50 V、120 min下轉移至PVDF膜，封閉，分別加入anti-p-AKT、anti-AKT、anti-p-ERK1/2和anti-ERK1/2（1∶500）4℃孵育過夜，加入HRP偶聯二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL曝光，以GAPDH為內參，Image PD軟件定量。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rh4對Molt4細胞的抑制作用 人參皂苷Rh4終濃度為0、10、20、40、60、80和100μmol/L時，抑制率分別為（0.00±0.00）%、（19.37±2.58）%、（32.58±3.67）%、（48.27±4.25）%、（63.85±5.92）%、（72.88±7.13）%、（80.51±8.68）%，提示人參皂苷Rh4可劑量依賴性抑制Molt4細胞，IC50為42.75μmol/L，因此，采用42.75μmol/L人參皂苷Rh4進行后續實驗。

2.2 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細胞增殖的影響 第48、72 h，Rh4組細胞增殖率顯著低于對照組（P＜0.05），Rh4+LY294002組和LY294002組細胞增殖率顯著低于Rh4組（P＜0.05），但Rh4+LY294002組和LY294002組差異無統計學意義（P＞0.05）。抑制PI3K/AKT后，人參皂苷Rh4抗增殖作用不顯著，提示人參皂苷Rh4可能通過抑制PI3K/AKT通路抑制Molt4細胞增殖，見表1。

表1 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through AKT pathway（±s）

表1 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through AKT pathway（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Rh4 group，2）P＜0.05.

Groups Control Rh4 Rh4+LY294002 LY294002 24 h 0.47±0.04 0.41±0.03 0.37±0.03 0.39±0.03 48 h 0.72±0.08 0.58±0.061）0.48±0.06 1）2）0.50±0.05 1）2）72 h 1.19±0.12 0.73±0.081）0.59±0.06 1）2）0.62±0.06 1）2）

2.3 人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細胞凋亡的影響 與對照組［（3.52±0.79）%］相比，Rh4組細胞凋亡率［（11.89±1.68）%］顯著升高（P＜0.05）。Rh4+LY294002組［（23.36±2.18）%］和LY294002組［（20.31±3.45）%］細胞凋亡率均顯著高于Rh4組（P＜0.05），但Rh4+LY294002組和LY294002組凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。采用LY294002抑制PI3K/AKT通路后，Rh4對Molt4細胞的凋亡促進作用減弱，提示人參皂苷Rh4通過AKT通路促進Molt4細胞凋亡，見圖1。

圖1 流式細胞術檢測人參皂苷Rh4通過AKT通路對Molt4細胞凋亡的影響Fig.1 Flow cytometry to detect effect of ginsenoside Rh4 on apoptosis of Molt4 cells through AKT pathway

2.4 各組細胞AKT通路磷酸化水平比較 Rh4組細胞p-AKT/AKT水平（0.82±0.08）顯著低于對照組（1.62±0.13）（P＜0.05），Rh4+LY294002組（0.18±0.02）和LY294002組（0.22±0.02）細胞p-AKT/AKT水平顯著低于Rh4組（P＜0.05），Rh4+LY294002組和LY294002組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測人參皂苷Rh4對AKT通路磷酸化水平的影響Fig.2 Western blot to detect effect of ginsenoside Rh4 on phosphorylation level of AKT pathway

2.5 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細胞增殖的影響 第48、72 h，Rh4組細胞增殖率顯著低于對照組（P＜0.05），Rh4+U0126組和U0126組細胞增殖率顯著低于Rh4組（P＜0.05），Rh4+U0126組和U0126組差異無統計學意義（P＞0.05）。采用U0126抑制MEK/ERK通路后，人參皂苷Rh4抗增殖作用減弱，提示人參皂苷Rh4可能通過抑制MEK/ERK通路抑制Molt4細胞增殖，見表2。

表2 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through ERK pathway（±s）

表2 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through ERK pathway（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Rh4 group，2）P＜0.05.

Groups Control Rh4 Rh4+U0126 U0126 24 h 0.51±0.05 0.43±0.04 0.38±0.04 0.40±0.05 48 h 0.76±0.07 0.61±0.071）0.49±0.071）2）0.53±0.061）2）72 h 1.22±0.13 0.76±0.091）0.61±0.081）2）0.65±0.071）2）

2.6 人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細胞凋亡的影響 Rh4組細胞凋亡率［（12.24±1.77）%］顯著高于對照組［（3.61±0.86）%］（P＜0.05）。Rh4+U0126組［（18.74±2.64）%］和U0126組細胞凋亡率［（17.28±2.57）%］均顯著高于Rh4組（P＜0.05），但兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。采用U0126抑制MEK/ERK通路后，Rh4的促細胞凋亡作用減弱，提示人參皂苷Rh4通過ERK通路促進Molt4細胞凋亡，見圖3。

圖3 流式細胞術檢測人參皂苷Rh4通過ERK通路對Molt4細胞凋亡的影響Fig.3 Flow cytometry to detect effect of ginsenoside Rh4 on apoptosis of Molt4 cells through ERK pathway

2.7 各組細胞ERK通路磷酸化水平比較 如圖4所示，Rh4組細胞p-ERK/ERK水平（0.81±0.09）顯著低于對照組（1.17±0.12）（P＜0.05），Rh4+U0126組（0.23±0.03）和U0126組（0.30±0.04）細 胞p-ERK/ERK水平顯著低于Rh4組（P＜0.05），兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 Western blot檢測人參皂苷Rh4對ERK磷酸化水平的影響Fig.4 Western blot to detect effect of ginsenoside Rh4 on phosphorylation level of ERK

3 討論

從分子水平上來說，T-ALL是一種異質性疾病，遺傳損傷和微環境因素是引起T-ALL的主要原因。T-ALL是由不成熟的T細胞前體細胞惡性轉化和克隆擴增引起的，成人T-ALL患者占所有T-ALL患者的25%，強化化療方案治療有效率為60%～80%，但多數患者出現復發和耐藥，預后較差［8］。

中藥抗腫瘤作用已受到廣泛關注，研究中藥活性單體化合物的抗腫瘤作用和機制可更好地發揮中藥的抗腫瘤作用。人參的生物活性成分已被明確定義，包括人參皂苷、多糖、酚類、類黃酮和聚乙炔等，人參皂苷是根據薄層色譜中的保留因子值命名的，包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、Rs3、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg4、Rh4和Rh5等，具有神經保護、抗氧化、血管生成調節和細胞毒活性作用［9］。研究顯示，人參皂苷Rh2可誘導白血病細胞凋亡，Rh4具有抗乳腺癌、食道癌等作用［10-12］。本研究初步研究了人參皂苷Rh4對T-ALL的作用，結果顯示人參皂苷Rh4可劑量依賴性地抑制人T-ALL細胞系Molt4的生長，在42.75μmol/L時抑制率約為50%。

為進一步分析人參皂苷Rh4抑制T-ALL的機制，課題組分別采用LY294002和U0126抑制PI3K和MEK激酶，從而抑制其下游AKT和ERK蛋白磷酸化激活，抑制AKT和ERK通路。在T-ALL的惡性進展和耐藥過程中，AKT和ERK通路均發揮促進作用［13-14］。研究顯示在其他腫瘤中，人參皂苷可抑制AKT及ERK磷酸化［15-16］。本研究通過體外研究證實了人參皂苷Rh4可抑制人T-ALL細胞系Molt4增殖并促進其凋亡，LY294002和U0126可顯著抑制Molt4細胞增殖和促進其凋亡，但在LY294002和U0126基礎上，人參皂苷Rh4對Molt4細胞的增殖抑制和促凋亡作用并不顯著。ZHONG等［17］研究顯示，人參皂苷Rg1可通過調控FGF2-AKT信號軸緩解衰老小鼠認知缺陷。也有研究顯示人參皂苷可通過抑制ERK調節炎癥反應緩解硫代乙酰胺誘導的小鼠肝纖維化［18］。提示人參皂苷Rh4可通過抑制AKT和ERK相關通路發揮抗T-ALL作用。

綜上所述，人參皂苷Rh4可通過抑制AKT和ERK通路抑制T-ALL細胞系Molt4增殖并促進其凋亡，人參皂苷Rh4的抗T-ALL作用和機制仍需進一步體內實驗研究。