銀杏內酯A對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠T細胞的免疫調節作用①

楊鵬偉 劉春云 穆秉桃 于婧文 肖保國 馬存根 （山西中醫藥大學國家中醫藥管理局多發性硬化益氣活血重點研究室神經生物學研究中心，山西中醫藥大學，太原030024）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）通常被定義為由T細胞參與介導的中樞神經系統（central nervous system，CNS）慢性炎癥性疾病，病變可累及大腦和脊髓，表現為局灶性斑塊形成、軸突變性和神經元丟失等［1］。MS的病理機制尚不明確，目前多應用實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE），一種表現出與MS相似病理與臨床癥狀的動物模型，來探究MS的自身免疫相關機制。目前認為，外周血中髓鞘特異性T細胞向CNS的遷移是EAE病程的起點，T細胞通過破壞的血腦屏障，同中樞免疫細胞（巨噬細胞與小膠質細胞）相互作用，促使炎癥性微環境形成，損傷少突膠質細胞和軸突，導致脫髓鞘和神經元功能障礙［2］。研究表明CD4+T細胞在EAE病理中發揮關鍵作用，因CD4+T細胞分泌的細胞因子功能不同，分為致炎型Th1/Th17細胞和抗炎型Th2/Tregs細胞，因此，調節CD4+T細胞亞群間平衡，維持自身免疫微環境穩定，是緩解EAE臨床癥狀的有效手段［3］。

血小板活化因子（platelet activing factor，PAF）是一種具有廣泛生物活性的磷脂類遞質，涉及多種病理反應，如神經損傷、動脈粥樣硬化、哮喘等［4］。近年來，天然PAF拮抗劑因其安全性較高和毒副作用小的特點，受到國內外研究者的廣泛重視，在對缺血性腦卒中的治療中，PAF拮抗劑表現出很好的抗炎和神經保護作用，減輕神經損傷，促進恢復期的神經功能恢復［5］。現代藥理學研究表明，銀杏內酯A（Ginkgolide A，GA），一種提取自銀杏葉的天然PAF拮抗劑，在改善CNS疾病上展現潛力。例如GA對腦缺血引起的損傷具有神經保護作用，能夠減輕海馬神經細胞的凋亡等［6］。在四氯化碳誘導的肝硬化模型和脂多糖誘導的炎癥模型中，GA也表現出很好的抗炎作用［7］。本研究觀察GA對EAE小鼠T細胞各亞群的影響，探討GA改善EAE的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10周齡的雌性C57BL/6小鼠，體重18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55，MOG35-55）由西安聯美生物科技有限公司提供；完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）購自美國Sigma公司；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）購自瑞士ENZO公司；結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，TB）購自美國BD公司；FITC標記的CD4抗體、PE標記的IL-17、IL-10、IFN-γ和TGF-β購自美國eBioscience公司；IL-17、IFN-γ、GAPDH一抗購自美國Abcam公司；HRP-goat antirabbit IgG二抗購自美國Pierce公司；GA購自上海嘉遠生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 冰凍切片機（Leica，型號：CM1950）；流式細胞儀（BD Biosciences，型號：BD FACSCaliburTMFlow Cytometer 342976）；高速冷凍離心機（Sigma，型號：3-18K）；光學熒光顯微鏡（Olympus，型號：BX51）；超聲波破碎儀（Sonics，型號：VCX800）；凝膠成像分析儀（Bio-Rad，型號：Universal HoodⅡ）。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備 實驗前將小鼠在無病原菌動物房飼養1周，給予小鼠常規的飼料和水。動物房環境為（25±2）℃，晝夜循環12 h。將小鼠按體質量分為3組，正常對照組（healthy control group，HC）、EAE對照組（EAE control group，EC）和EAE治療組（EAEtreatment group，ET），8只/組。生理鹽水溶解MOG35-55粉末，與含有結核桿菌素（TB）的完全弗氏佐劑等體積（1∶1）混合，于冰上用針管混合器反復抽推2 h形成油包水樣抗原乳劑。以0.1 ml/只在EC和ET組小鼠脊柱兩側皮下分4點注射抗原乳劑。并于免疫當天和免疫后48 h分別腹腔注射PTX（350 ng/只）以增強免疫反應。小鼠尾部張力下降，即為EAE開始發病，表明模型制備成功。

1.2.2 給藥和臨床觀察 將GA溶解于二甲基亞砜（DMSO），并以生理鹽水稀釋至DMSO終濃度為1.5%，ET組以15 mg/（kg·d）灌胃給藥，劑量為0.2 ml/（次·只）。從免疫后第10天持續至免疫后第28天，EC和HC組則給予同體積生理鹽水。2位實驗員每天記錄各組每只小鼠的體重和臨床癥狀，神經功能評分標準采用國際通用的Kono 5分法，癥狀介于兩者標準之間者以±0.5分計。0分：不發??；1分：尾部張力降低；2分：尾部拖地，蹣跚步態；3分：后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓，爬行明顯減少；5分：瀕臨死亡或死亡［8］。

1.2.3 標本制備 免疫后第28天，取各組4只小鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，滅菌器械無菌操作下取小鼠脾臟，置于裝有DMEM培養液的15 ml離心管。打開小鼠胸腔剪開右心耳，將注射器針頭刺入左心尖，推注生理鹽水觀察至肝發白，冰上快速取小鼠脊髓，置于-80℃冰箱保存待用。另各組取4只小鼠，麻醉后先推注生理鹽水，再用4%多聚甲醛灌注固定，冰上迅速取脊髓組織，OCT包埋后用液氮快速冷凍，冰凍切片機將標本切成10μm切片，后續將脊髓冰凍切片行常規HE和LFB染色。

1.2.4 脾臟單個核細胞制備 將脾臟置于培養皿中沖洗后，置于40μm尼龍篩網上倒少許DMEM培養液，用一次性注射針針柄端研磨，收集細胞混懸液，離心棄上清，重懸脾細胞加ddH2O和2.7%NaCl（2∶1）破紅細胞膜，取出各組絮狀物配平離心，棄上清重懸，制備成單個核細胞（mononuclear cells，

MNCs）。

1.2.5 流式細胞術檢測T細胞 細胞計數后，1×PBS清洗各組MNCs，棄上清重懸后各取3×106個/ml MNCs懸于50μl 1%BSA-PBS緩沖液或50μl 0.1%saponin破膜劑，加1μl FITC-CD4+PE-IL-10、PEIFN-γ、PE-TGF-β和PE-IL-17抗體，室溫避光孵育30 min。隨后加3 ml PBS清洗2次，離心后棄去洗液，加入300μl PBS將底部細胞混勻，避光待流式細胞儀檢測。

1.2.6 Western blot 將各組EP管中的脊髓剪碎，加預冷的裂解液置于冰上，超聲波破碎儀裂解組織，冰上靜置10 min。4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，調整蛋白濃度后加loading buffer上樣緩沖液，煮沸7 min使蛋白變性。制備SDS-PAGE 10%分離膠和5%濃縮膠，上樣后，先調至70 V電壓跑膠，待蛋白跑至分離膠將電壓調為110 V，直至凝膠底部，轉膜至PVDF膜，穩流200 mA約2 h，將膜放入TBST清洗3次，5 min/次，洗后加5%脫脂奶粉封閉2 h，再加入脫脂奶稀釋的IL-17（1∶1 000）、IFN-γ（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）一抗，置于4℃孵育過夜。第2天TBST洗膜后孵育相應二抗，HRP偶聯羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫孵育2 h，洗滌3次后凝膠成像分析儀成像，Image-Lab分析條帶。

1.3 統計學處理 原始數據采用GraphPad Prism軟件進行分析，體重和臨床平均分數采用秩和檢驗，其他數據采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GA延遲EAE小鼠的發病時間并緩解其臨床癥狀 免疫后第11天左右，EAE小鼠逐漸出現行為學變化，從尾部下垂無力、步態失調發展至后肢癱瘓、爬行減少，并伴隨形體消瘦、精神萎靡。如表1所示，EC組發病率為100%，平均最高臨床評分為（3.31±1.75）分，平均發病時間為（12.25±1.20）d；與EC組相比，ET組小鼠發病率較低，平均發病時間延緩，平均最高臨床評分顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。同時與HC組相比，EC組小鼠體重丟失伴隨臨床癥狀加重；與EC組相比，ET治療組小鼠體重減輕程度較小（P＜0.05），臨床評分較低（P＜0.05，P＜0.01），表明GA治療可減輕EAE小鼠臨床癥狀（圖1）。

圖1 各組平均臨床評分和體重變化Fig.1 Mean clinical scores and weight changes in each group

表1 HC、EC、ET組臨床發病情況（xˉ±s，n=8）Tab.1 Clinical morbidity in HC，EC and ET groups（xˉ±s，n=8）

2.2 GA緩解EAE小鼠脊髓病理變化 正常小鼠脊髓切片HE染色下炎癥細胞浸潤較少，LFB染色下髓鞘組織完整；EC組小鼠表現出典型病理特征，炎癥細胞大量浸潤（P＜0.01），白質區髓鞘脫失（P＜0.001）。與EC組相比，ET治療組可有效抑制炎癥細 胞 浸 潤（P＜0.05），減 輕 髓 鞘 脫 失 程 度（P＜0.001）。見圖2、3。

圖2 各組小鼠脊髓HE染色Fig.2 Spinal cord of mice in each group was stained with HE

2.3 GA調節外周T細胞亞群 免疫后第28天制備脾MNCs，檢測各組T細胞亞群變化，如圖4所示，與EC組相比，ET組IL-10和TGF-β的CD4+T細胞亞群比例表達上調（P＜0.000 1），IL-17和IFN-γ的CD4+T細胞亞群比例表達下調（P＜0.05）。結果表明，GA能夠調節外周T細胞亞群Th1/Th17和Th2/Tregs的平衡。

圖4 GA調節CD4+T細胞亞群比例Fig.4 GA regulatesproportion of CD4+T cell subsets

2.4 GA影響EAE脊髓IL-17和IFN-γ表達 Western blot顯示，EC組脊髓內炎癥因子IL-17和IFN-γ表達較高，與EC組相比，ET治療后可抑制IL-17（P＜0.01）和IFN-γ（P＜0.05）表達，見圖5。

圖3 各組小鼠脊髓LFB染色Fig.3 Spinal cord of mice in each group was stained with LFB

圖5 GA抑制炎癥細胞因子的表達Fig.5 GA inhibits expressions of inflammatory cytokines

3 討論

MS病機復雜，又兼具高致殘性和易復發性的特點，臨床尚無特效藥能治愈。現有治療MS的有效藥如：IFN-β，可抑制IFN-γ，減少Th1細胞活化生成；納塔利珠單抗，能阻止B細胞和T細胞遷移到中樞神經系統；米托蒽醌，可抑制淋巴細胞和單核細胞遷移，下調TNF-α和IFN-γ的分泌等［9］。這些藥物通過影響外周免疫細胞向中樞神經系統浸潤，調節炎癥誘導型Th1/Th17和炎癥修復型Th2/Treg細胞的失衡，從而降低復發緩解期多發性硬化（RRMS）的復發率。EAE是一種經典的RRMS小鼠模型，表現出與MS相似的病理特征，如外周免疫細胞激活、血腦屏障破壞、CNS中炎癥浸潤、軸突變性和髓鞘損傷等，常用作MS的病理研究和藥物篩選［10］。近期研究表明，苦參素通過調節炎癥誘導型細胞Th1/Th17分化下調細胞因子IL-17和IFN-γ分泌，從而緩解EAE病程［11］；S1PR1基因慢病毒通過S1P/S1PR1信號通路使T細胞遷移受阻，改善EAE發?。?2］。因此，針對MS病理起始階段的干預，即減少外周免疫細胞向中樞遷徙浸潤，調節其不同表型介導的炎癥性微環境的穩定，仍為治療MS的有效手段。

近年來，黃芪甲苷、雷公藤甲素、穿心蓮內酯等萜類天然產物對EAE小鼠病程表現出較好的干預作用，具有療效好、作用明確、潛在安全性好等生物活性特點，可能在治療EAE的實驗研究中開辟新的領域［13-14］。銀杏內酯為萜類化合物，其有效成分GA亦是高效的PAF受體拮抗劑，在多種炎癥及免疫疾病的研究中，GA的抗炎和神經保護作用得以證實［6-7］。目前，尚無有關GA對EAE小鼠療效的探究，盡管GA具有較強的生物活性，然而最新研究提出GA的溶解性和滲透性差，導致其生物利用度較低，結合其應用劑型局限性的特點，本實驗采用口服給藥以探究GA對EAE小鼠的療效［15］。

本研究應用GA在EAE病程初期進行干預治療，結果表明ET組發病率低于EC組，延緩了EAE小鼠的平均發病時間，在臨床癥狀方面，ET組臨床評分相比EA組較低，各組體重趨勢與臨床癥狀嚴重程度相對應，證實GA干預治療可有效緩解EAE小鼠的臨床癥狀。MS患者的脫髓鞘發生在大腦和小腦皮質，而EAE主要影響脊髓白質區，并伴有由淋巴細胞和巨噬細胞構成的炎癥性病變，外周浸潤的淋巴細胞可因抗原提呈作用介導炎癥反應擴大，造成少突膠質細胞和神經元損傷，最終導致髓鞘破壞［16］。HE和LFB染色結果顯示，與EC組相比，ET組的炎癥細胞浸潤數量較少，髓鞘脫失程度較輕，提示GA能夠抑制免疫細胞在中樞的募集，進而減輕炎性微環境對髓鞘的損傷。

EAE的發病機制與CD4+T細胞介導的免疫應答密切相關，CD4+T細胞經活化分化為不同的效應亞群：Th1細胞參與機體對細胞病原體的防御，可由IL-12、IFN-γ誘導分化，其分泌的IFN-γ能夠激活巨噬細胞產生一氧化氮（NO），促進炎癥反應和組織損傷［17］；Th2細胞主要產生IL-4、IL-5和IL-10等，其中IL-10通過調節參與抗原提呈的細胞因子和分子的表達控制炎癥，IL-10可抑制單核細胞中細胞因子和趨化因子TNF、IL-1和IL-12產生，抑制Th1細胞分化［18］；Th17細胞是有效的細胞介導效應器，其分泌的IL-17是參與EAE炎癥的重要介質，IL-17可通過誘導黏附分子、促炎細胞因子、趨化因子表達促進炎癥［19］；Treg可通過分泌抑制性細胞因子IL-10或TGF-β抑制炎癥和免疫反應，在無明顯炎癥的情況下，TGF-β促進Treg細胞分化，而在促炎因子IL-6的協同下，TGF-β參與Th17細胞的誘導，因此維持Th17/Treg的平衡對改善EAE病程至關重要［20］。脾臟MNCs是影響EAE的主要外周免疫細胞，為探討GA治療EAE小鼠的細胞分子機制，本實驗采用流式細胞術檢測脾臟MNCs的CD4+T細胞各亞群比例，結果證實GA可有效抑制CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞比例，并增強CD4+IL-10+和CD4+TGF-β+T細胞表達。GA對EAE的免疫調節機制是通過促進致炎型Th1和Th17細胞向調節型Th2和Treg細胞轉化實現的。

T細胞介導的炎癥是EAE的病機核心，控制炎癥的策略除了調節CD4+T細胞分化外，還有減少CD4+T細胞向CNS遷移。研究表明IFN-γ可上調MHCⅡ類分子和內皮細胞上的黏附分子，促進T細胞向中樞神經系統遷移；此外，IL-17能誘導趨化因子產生，通過促進免疫細胞向CNS滲透，在傳播炎癥方面發揮作用［21］。本實驗結果表明，GA可抑制脊髓中IL-17和IFN-γ表達，通過抑制炎癥細胞因子釋放，減少CD4+T細胞向中樞募集，維持中樞微環境穩定，避免EAE炎癥進一步擴大。

綜上所述，GA能改善EAE的臨床癥狀，減少CNS炎癥和髓鞘脫失情況，其作用機制可能與下調外周Th1/Th17致炎細胞、增強Th2/Treg調節性細胞表達、抑制炎癥細胞因子IL-17和IFN-γ對中樞炎性微環境的促成有關。本研究為今后GA治療EAE的免疫機制研究提供了實驗依據。