基于免疫學機制探討Twist2上調與牙周炎發生發展的關系①

牛 羚 陳 雷 孫 琳 劉欣蔚 劉立峰（北華大學附屬醫院，吉林132011）

牙周炎是一種常見可導致成人牙齒非正常脫落的重要疾病，是由革蘭氏陰性厭氧桿菌感染導致的牙齒慢性骨吸收病變［1］。感染后細菌持續廣泛地損傷牙周組織，隨時間推移，各種慢性病癥累積，出現牙齦出血、牙齦炎、牙槽骨吸收、牙齒松動甚至脫落等多種病癥，嚴重影響牙齒健康和生活質量。目前，無論是藥物還是手術治療牙周炎多為對癥治療，無法實現牙周組織再生和修復。牙齒形成和維護是成骨與破骨的動態平衡過程，牙周炎中炎癥環境抑制成骨細胞活動，導致牙槽骨骨代謝平衡失調。Twist2是一種對骨骼發生和發育起重要調節作用的基因，通過抑制成骨細胞生長使其停滯于前成骨細胞階段，從而抑制骨形成［2-4］。Twist2表達于軟骨發育早期的成軟骨細胞和周圍間質細胞細胞核中，發揮轉錄因子作用［4-5］。研究顯示，Twist2對人牙周韌帶間充質干細胞成骨分化具有調節作用，而Twist2與牙周炎發生發展是否相關尚未闡明，本研究通過模擬牙周炎炎癥環境對牙周膜細胞中Twist2表達狀況進行檢測，初步探討Twist2與牙周炎的關系，以期為牙周炎發生的免疫學機制和的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙周膜細胞及牙齒 牙周膜細胞均從門診收集的健康牙齒上刮取，所有牙齒為因正畸需要而拔除的15～25歲青年的健康恒磨牙。

1.1.2 主要試劑與儀器 α-MEM培養基、0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、青霉素、鏈霉素、胎牛血（FBS）、Trizol試劑盒、qRT-PCR試劑盒（美國Invitrogen）；轉錄試劑盒（北京Transgen公司）；多聚甲醛（PFA）、細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司）；磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯色試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；PVDF膜（美國Milli Pore公司）；PCR檢測試劑盒（TaKaRa公司）；電泳儀（愛寶來濟南生物技術有限公司）；酶標儀（北京普朗新技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞獲取與培養 將磨牙牙根面用含雙抗的無菌PBS液反復沖洗，冠部采用75%酒精浸泡2 min，無菌條件下刮下牙根面1/3的牙周膜，無菌PBS液清洗，剪碎移至離心管，加入Ⅰ型膠原酶，37℃水浴消化20 min，終止消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mlα-MEM培養液（含10%胎牛血清、100μg/ml抗壞血酸、2 mmol/L谷胺酰胺，0.5μg/ml青-鏈霉素），將細胞吹勻后接種至6孔板，37℃、5%CO2培養傳代。

1.2.2 LPS模擬體外炎癥環境 將傳代后生長良好的牙周膜細胞以2×105個/ml接種至6孔板，加入α-MEM培養液，37℃、5%CO2培養至80%融合，去除原培養液，隨機分為對照組和實驗組，對照組加入α-MEM培養液，實驗組加入含1μg/ml LPS的α-MEM培養液，繼續培養24 h用于后續實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測Twist2表達 將培養24 h的2組細胞于無菌環境下去除培養基，加入Trizol試劑完全裂解，提取總RNA，Nano DropRND-1000檢測RNA濃度和純度。逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，按照400 ng反轉10μl體系將總RNA進行反轉錄，按照反轉錄試劑盒說明書操作，采用qPCR試劑盒進行qRT-PCR檢測，以U6為內參，引物由Invitrogen公司合成，序列如下：GAPDH F：5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3'（203 bp），R：5'-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3'；Twist2 F：5'-GCAAGAAGTCGAGCGAAGAT-3'（96 bp），R：5'-GCTCTGCAGCTCCTCGAA-3'。

1.2.4 Western blot檢測Twist2蛋白表達 將牙周膜細胞裂解后離心收集上清，得到總蛋白，BCD法測定蛋白濃度。將樣品蛋白移入預制的聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃反應過夜，PBST洗膜5次，加入二抗（1∶1 500），常溫搖床孵育1 h，PBST快速洗滌10 min，反復3次，暗室中紅外線下發光液進行化學發光，曝光、顯影、定影。掃描儀掃描膠片，目標條帶灰度值分析，結果以目的蛋白條帶光密度與內參蛋白條帶光密度比值表示，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，加權處理后進行兩組獨立樣本非參數秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測Twist2 mRNA表達 qRT-PCR結果顯示，1μg/ml LPS刺激24 h后，與對照組相比，實驗組Twist2 mRNA表達顯著增加（P＜0.05），LPS處理后形成的炎癥環境中Twist2 mRNA表達上調，炎癥牙周膜細胞中Twist2 mRNA升高為正常牙周膜細胞的3倍（圖1），說明Twist2 mRNA與牙周炎發生密切相關。

圖1 2組細胞中Twist2 mRNA表達Fig.1 Expression of Twist2 mRNA in two groups of cells

2.2 Western blot檢測Twist2蛋白表達 Western blot結果顯示，1μg/ml LPS刺激24 h后，與對照組組比，實驗組Twist2蛋白表達升高（P＜0.01），炎癥環境中Twist2蛋白表達上調（P＜0.01，圖2）。

圖2 Western blot檢測Twist2蛋白表達Fig.2 Western blot to detect expression of Twist2 protein

3 討論

牙周炎是嚴重危害牙齒健康的慢性炎癥性口腔疾病，是由牙周致病菌引起的炎癥繼發性骨吸收病變。牙周炎引起的各種牙齒損傷嚴重影響患者咀嚼進食，影響患者生活質量［6］。牙周炎現有治療方法以抑制炎癥為主，無法實現牙周骨組織修復再生，治療結果不理想。牙周炎中炎癥發展破壞成骨細胞和破骨細胞所維持的骨代謝的平衡，成骨細胞生長被各種炎癥因子抑制，導致基質分泌礦化受阻。研究牙周炎牙槽骨吸收機制，尋找抑制骨吸收、促進骨形成的靶點對于防治牙周炎牙槽骨吸收具有重要意義。

Twist2是位于人2q37.3染色體、與真皮發育相關的細胞因子［7-8］。Twist2對骨骼發育、真皮發育、腫瘤生成及轉移具有調節作用。，隨人成骨細胞分化水平進展，Twist2 mRNA含量先增加后減少。研究顯示，成骨細胞系MC3T3在分化過程中Twist2表達下調，提高Twist2表達，骨鈣素（OC）和/或堿性磷酸酶（AP）含量下降，成骨細胞發育被抑制，停留于前成骨細胞階段，骨形成被抑制［5］。采用Jagged-1處理牙周韌帶間充質干細胞（HPDLs）分化后，Twist2 mRNA表達下調，而Notch通路靶基因hes-1、hey-1表達上升，HPDLs成骨增多，說明Twist2參與HPDLs分化調節過程［9］。本研究采用qRT-PCR和Western blot對正常牙周細胞和模擬炎癥環境中的牙周細胞中的Twist2 mRNA及蛋白表達進行檢測發現，炎癥環境中Twist2 mRNA和蛋白表達均上調，說明Twist2與牙周炎發生發展相關，其作用機制可能為由于炎癥及免疫細胞及因子刺激促進Twist2表達，導致牙周組織中成骨細胞分化受抑制，成骨被抑制，破骨相對增加，二者平衡被打破，牙槽骨被吸收卻無法進行成骨補充，導致牙根部破壞，甚至牙齒損毀脫失。本研究顯示，Twist2上調可能是牙周炎發生發展的相關因素，但未對其作用通路及機制進行深入研究，其與牙周炎發生發展如何作用及作用靶點有待進一步研究。

綜上所述，炎癥環境中Twist2表達上調，提示其與牙周炎發生發展中的骨吸收相關，可能成為抑制牙齒骨吸收或修復牙再生的靶點，為臨床防治牙齒脫落提供新思路。