信號素6d（Sema6d）對樹突狀細胞天然免疫功能的影響及機制研究①

程玉潔 劉 娟（海軍軍醫大學免疫學研究所暨醫學免疫學國家重點實驗室，上海200433）

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）作為天然免疫和獲得性免疫的連接橋梁，在維持免疫穩態、調節免疫平衡中發揮關鍵作用［1］。DC的數量、功能異常與炎癥性疾病、自身免疫性疾病等免疫相關性疾病的發生發展密切相關［2-3］。鑒定DC分化發育和功能活化的關鍵調節蛋白對于深入了解免疫應答的內在規律、尋找免疫性疾病新型發病機制具有重要意義。

不同的DC亞群及其不同的功能狀態在免疫應答中發揮多樣化的調節作用［4］。外周未成熟DC（immature DC，imDC）在受到炎癥環境或抗原刺激下攝取抗原并加工為抗原肽，同時分泌IL-6、TNF等炎癥性細胞因子，在此過程中逐漸發育為成熟DC（mature DC，mDC），并在細胞膜表面趨化因子受體CCR7的相應趨化因子配體19（chemokine ligand 19，CCL19）和趨化因子配體21（chemokine ligand 21，CCL21）的誘導下向次級淋巴結遷移，最終向T細胞提呈抗原肽，進而活化T細胞反應。DC攝取抗原后迅速啟動遷移過程，并在后期及時終止，以保證機體在及時啟動保護性免疫應答的同時避免免疫反應過度造成自我損傷［5］。課題組前期研究發現長鏈非編碼RNA lnc-dpf3通過缺氧誘導因子HIF-1α途徑抑制CCR7依賴的DC遷移，進而負向調節炎癥性疾病的發生［6］。同時，也有文獻提示CCL19在DC凋亡過程發揮調控作用［7］。因此，需要進一步探究體內是否存在其他機制對DC成熟活化和遷移功能的平衡進行精密調控，促使機體能夠及時清除病原體，同時避免不必要的炎癥損傷。

信號素家族為一類含有共同胞外信號素結構域的蛋白家族，在神經發育、骨骼形成、肝臟、腎臟等器官功能中發揮重要調節作用［8-13］。多個信號素家族成員在免疫系統發育及免疫細胞功能中可能發揮重要調節作用。比如，信號素4d能夠促進DC活化并誘導T細胞啟動免疫應答［14］；信號素7a可通過整合素途徑活化T細胞以啟動免疫應答，同時通過整合素和絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路促進神經軸突的生長［15-16］。表達信號素6a分子的朗格漢斯細胞（langerhans cell，LC）在功能未成熟狀態時表達趨化因子受體CCR7并具有體內遷移功能，提示信號素6a在抗原提呈細胞的天然免疫功能中可能發揮調節作用［17］。DC是體內最重要的抗原提呈細胞，關于信號素6亞家族成員（Sema6a、6b、6c、6d）在其成熟、活化及遷移過程中具體發揮何種功能尚不清楚。因此，本研究通過篩選，獲得在CCL19/CCL21刺激后表達量顯著上調的信號素亞家族分子信號素6d（Semaphorins 6d，Sema6d），并探究該分子在DC成熟、活化和遷移中發揮的調節作用及機制，為機體天然免疫應答提供新的分子機制解釋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡C57BL/6J雄鼠，體重16～20 g，動物許可證號：scxk（滬）2018-0006，購自上海西普爾-必凱公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 基礎培養基PRIM1640購自Gibco公司；胎牛血清購自Biowest公司；重組小鼠CCL19、CCL21、粒細胞巨噬細胞刺激因子、IL-4購自R&D公司；轉染試劑Lipofectamine2000、緩沖液購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、TB green購自TaKaRa公司；紅細胞裂解液、流式抗體購自BD公司；BCA試劑盒、顯影發光底物購自Thermo Fisher公司；蛋白免疫印跡抗體購自CST和Abcam公司；RNA Fast 2000試劑盒購自飛捷公司；遷移孔板購自康寧公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、蛋白酶抑制劑Cocktail、PMSF購自Sigma公司；小干擾RNA由上海吉瑪公司合成；5×Loading buffer購自生工公司；LSRFortessa流式細胞儀購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）的培養及刺激 取6～8周齡雄鼠，頸椎脫臼處死，取股骨和脛骨骨髓組織，注射器反復吹打分散，過濾，離心獲得細胞沉淀，加入1 ml 1×紅細胞裂解液，混勻后靜置3 min破紅，加入2 ml 1×PBS終止破紅，3 000 r/min離心5 min，棄上清獲得細胞沉淀，加入18 ml細胞培養基（500 ml PRIM1640+50 ml胎牛血清+55μl 100 ng/μl GMCSF+11μl 50 ng/μl IL-4），充分混勻后均勻接種至6孔板。以培養當天算作第0天，分別在第2和第4天每孔補充DC培養液1 ml，第5天加入LPS（100 ng/ml）刺激12 h促其成熟。

1.2.2 小RNA干擾 成熟細胞鋪板后，靜置2～3 h使其穩定，3×105個細胞以100μl緩沖液+1μl小干擾RNA+3μl干擾用混合液，6×105個細胞以200μl緩沖液+2μl小干擾RNA+5μl干擾用混合液緩慢滴入。干擾24～48 h后檢測細胞天然免疫功能及信號通路活化。干擾RNA序列見表1。

表1 干擾RNA序列Tab.1 Interference RNA sequence

1.2.3 總RNA的提取及逆轉錄 根據試劑盒說明書提取RNA，取13.5μl RNA、4μl MLV緩沖液、1μl脫氧核糖核苷三磷酸、1μl多聚胸腺嘧啶、0.5μl逆轉錄酶混勻，然后以72℃59 min，42℃15 min的PCR程序逆轉錄。逆轉錄結束后加入60μl無菌水稀釋獲得cDNA。

1.2.4 熒光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR，qPCR）根據試劑盒說明書進行qPCR，擴增體系為每孔5μl滅菌水+10μl TBgreen+1μl目標引物+4μl cDNA，PCR程序在quant studio flex7儀器上完成。以β-actin的循環數值作為背景并減去，2ΔCt公式計算獲得樣品的擴增倍數。引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Tab.2 Primers used for qPCR

1.2.5 流式微球技術（cytometric bead array，CBA）根據CBA檢測試劑盒進行細胞上清蛋白定量檢測。50μl細胞上清加入1μl捕獲微球和50μl檢測液，室溫避光結合1 h后加入1μl檢測微球和50μl檢測液，繼續室溫避光結合2 h后加入800μl洗液，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200μl 1×PBS，流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 細胞遷移實驗（Transwell assay） 本實驗在含有8μm孔徑聚碳酸酯過濾器的24孔遷移板進行。提前30 min在遷移板下層室加入600μl 10%1640培養基，上層室加入100μl 10%1640培養基并于37℃孵箱預熱。將對照組和干擾組細胞數量調整至100μl，培養基內含有3×105個細胞，吸凈預熱用培養基后，下層室加入600μl 10%1640培養基，設置對照孔和實驗孔，實驗孔中加入CCL19和CCL21（50 ng/ml），對照孔不添加，在上層室加入細胞。37℃共孵育12 h后收集下層室細胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200μl 1×PBS，流式細胞儀記錄1 min內檢測到的細胞數量。以對照孔內自發遷移的細胞數為背景，減去背景后得到遷移細胞數量。以對照組遷移數量為基礎值，實驗組遷移數量除以基礎值得到實驗組相對遷移比值。

1.2.7 Western blot

1.2.7.1 制備樣品 細胞干擾48 h后收集至1.5 ml離心管，3 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入100μl按比例配制的細胞裂解液，4℃振蕩裂解30 min后，12 000 r/min離心10 min，將上清轉移至新的1.5 ml離心管，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，在上清中加入20μl 5×loading buffer，10 min水浴煮沸制備。

1.2.7.2 免疫印跡 根據待檢測的蛋白分子量大小制備相應濃度的電泳凝膠，取20μg蛋白樣品進行電泳分離（80 V，室溫，3 h）、轉膜（300 mA，4℃，90 min）、封閉（5%BSA，室溫，2 h），孵育盒中加入按說明書稀釋的一抗，4℃過夜。次日以1×TBST，10 min×4次洗凈一抗后加入按說明書稀釋的相應二抗，室溫孵育1～2 h。孵育結束后，1×TBST，10 min×4次洗凈。參照顯影試劑盒說明書配制顯影發光底物，將膜置于底物溶液中孵育，在顯影儀下曝光拍照。

1.2.8 流式細胞術 細胞干擾24 h后收集至1.5 ml離心管，3 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入50μl 1×PBS和1μl相應流式抗體，室溫避光結合20 min后加入1 000μl 1×PBS清洗，3 000 r/min離心5 min，棄上清后加入200μl 1×PBS上機檢測。

1.3 統計學處理 采用雙尾t檢驗統計分析差異顯著性，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，NS（not significant）表示差異無統計學意義。

2 結果

2.1 CCL19/CCL21刺激12 h后信號素6d表達量改變 成熟DC鋪板后加入CCL19/CCL21刺激12 h，收集細胞并獲得cDNA后，qPCR檢測信號素6a、6b、6c和6d mRNA水平變化。結果顯示，經CCL19/CCL21刺激后，信號素6a和信號素6c表達量無明顯變化，信號素6b表達下調，信號素6d表達上調（圖1）。提示趨化因子配體刺激后可誘導信號素6d分子表達量上調。因此，鎖定信號素6d為目標研究分子。

圖1 DC在CCL19/CCL21刺激12 h后信號素6d表達上調Fig.1 Expression of Sema6d in DC was up regulated after stimulation of CCL 19/CCL21 for 12 h

2.2 干擾信號素6d對DC膜表面標志物和凋亡功能的影響 以小RNA干擾實驗研究信號素6d功能。成熟DC分別使用si-NC和si-Sema6d干擾36 h并獲得cDNA，qPCR檢測信號素6d mRNA水平表達量變化結果顯示，si-Sema6d處理后信號素6d表達量著下調，表明信號素6d被有效干擾（圖2A）。流式細胞術檢測DC干擾信號素6d分子24 h后膜表面標志物以明確該分子是否影響細胞成熟、活化。結果表明，與對照組相比，干擾組DC膜表面標志物CD11c、CD40、CD86和CD80無明顯差異（圖2B）。同時檢測成熟DC干擾信號素6d分子24 h并使用CCL19/CCL21刺激12 h后的凋亡標志物。結果顯示，細胞凋亡標志無明顯變化（圖2C）。以上結果提示，信號素6d對細胞膜表面成熟標志物及凋亡功能無明顯影響。

圖2 信號素6d干擾后DC膜表面成熟標志物和凋亡功能無變化Fig.2 Expression of surface markers and apoptosis function did not change after Sema6d interference in DC

2.3 干擾信號素6d對DC天然免疫功能的影響qPCR和流式微球實驗檢測干擾信號素6d 36 h并LPS刺激12 h后細胞炎癥因子表達量變化，同時通過體外遷移實驗檢測遷移功能變化。結果顯示，信號素6d干擾后炎癥因子表達上調（圖3A），而遷移功能下調（圖3B）。以上實驗結果證明，信號素6d分子在成熟DC中發揮抑制炎癥因子分泌，同時促進趨化因子介導的細胞遷移作用。

圖3 信號素6d干擾后對DC天然免疫功能的影響Fig.3 Effect of Sema6d interference on DC innate immune function

2.4 干擾信號素6d對MAPK和NF-kB信號通路的影響 Western blot檢測MAPK通路和NF-κB通路相關信號蛋白在細胞干擾48 h，并分別以LPS或CCL19/CCL21刺激不同時間點的表達。結果顯示，干擾信號素6d后，LPS刺激后的MAPK信號蛋白pp38和p-Erk表達下調，而NF-κB信號蛋白p-p65表達上調，提示信號素6d分子可能通過抑制p-p65的活化發揮抑制LPS刺激的炎癥因子分泌的功能。而在干擾信號素6d后，CCL19/CCL21刺激的p-p38、p-Erk及p-p65表達均下調，提示信號素6d分子能夠廣泛促進細胞遷移信號觸發的MAPK及NF-κB通路相關蛋白表達變化（圖4）。以上結果提示，信號素6d分子對LPS或CCL19/CCL21刺激的MAPK和NFκB信號通路發揮差異化調控作用。

圖4 信號素6d干擾后對MAPK和NF-κB信號通路關鍵蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Sema6d interference on expressions of key molecules of MAPK and NF-κB signaling pathways

3 討論

信號素6d分子在調控帕金森疾病、心臟疾病及急性腎損傷過程中發揮關鍵調控作用，并被發現是骨肉瘤及三陰性乳腺癌治療的關鍵靶點［18-20］。但該分子在免疫細胞功能調節中的作用尚不清楚。本研究證實信號素6d分子在天然免疫中具有重要調控作用。CCL19和CCL21刺激可誘導信號素6d表達量著上調，上調的信號素6d分子能夠反饋性地抑制脂多糖引發的炎癥反應，同時促進趨化因子介導的細胞遷移。因而，信號素6d分子促使免疫系統在受到病原體刺激后能夠抑制過度的炎癥因子分泌，同時及時啟動細胞遷移，是DC實現免疫調控、維持免疫平衡的重要分子。

代謝調控作為一種動態精準的胞內調控方式得到廣泛關注。已有研究證實了胞內糖酵解途徑在DC的炎癥反應及遷移過程中發揮重要作用［21］。近期研究發現，mTOR信號通路在信號素6d調控巨噬細胞的抗炎極化和脂質代謝過程中發揮重要作用［22］。本課題組發現，信號素6d分子在DC中能夠促進CCL19/CCL21刺激后的p-p65活化，抑制LPS刺激后的p-p65信號活化。信號素6d分子是否通過影響胞內代謝通路活化，或借助某些代謝產物的改變發揮影響DC的天然免疫信號及活化和遷移功能仍有待進一步研究。

CCL19/CCL21與DC膜表面趨化因子受體相結合以觸發細胞遷移。信號素6d通過何種方式調控趨化因子受體與配體間介導的信號通路活化以實現促進細胞遷移的功能尚不明確。文獻提示信號素家族的信號素結構域通過與叢狀蛋白受體結合參與誘導肌動蛋白絲在細胞質膜上的重組并促進細胞遷移［23］。信號素6d是否依賴叢狀蛋白受體影響趨化因子受體內化及下游信號激活，是否通過其信號素結構域影響細胞骨架系統重塑，進而影響細胞遷移運動仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現了信號素6d分子在DC天然免疫功能中的重要調控作用，揭示了免疫平衡的新型調控機制，可能為DC功能紊亂相關炎癥性疾病、自身免疫性疾病提供新型機制揭示和潛在防治靶標。