腸道菌群的環境毒理學研究：現狀與展望

劉月月， 王 琛， 趙曉麗， 吳豐昌， 白英臣， 滕苗苗， 汪 霞， 時 迪

中國環境科學研究院， 環境基準與風險評估國家重點實驗室， 北京 100012

腸道菌群是寄居在宿主腸道中微生物群落的總稱，其與宿主互利共生，可以通過菌體的自身成分、代謝物、衍生物等調節腸道局部免疫平衡，參與機體免疫微環境的塑造，幫助宿主完成多種生理生化功能[1]. 越來越多的流行病學與毒理學研究表明，腸道菌群紊亂和失衡與多種人類非傳染性疾病(non-communicable diseases, NCDs)密切相關. 腸道菌群異常(如多樣性降低、特定成員和功能改變等)可能參與糖尿病[2]、非酒精性脂肪肝[3]、炎癥性腸病[4]、自身免疫性關節炎[5]、肥胖癥[6]、哮喘等[7]等多種疾病的發生. 此外，短鏈脂肪酸、脂多糖、次級膽汁酸等腸道菌群的代謝產物和衍生物，也能與宿主的一些生理途徑相互作用，并通過“腦—腸—腸道菌群軸”誘發自閉癥[8]、代謝綜合征[9]、老年癡呆癥[10]等疾病.

隨著現代社會的快速發展，化學物質的制造量和使用量日益增長，這些物質會釋放到環境中，通過多種環境介質及食物鏈對人類和動物健康產生影響，其中經口暴露是絕大部分污染物產生毒害效應的暴露途徑[11]. 腸道菌群與宿主的胃腸消化系統是人類及眾多環境生物抵御外源污染物侵襲的第一層屏障. 研究[12-13]證實，腸道菌群易受飲食和抗生素等外源因素的影響，且對環境污染物表現出極高的敏感性. 環境污染物的暴露可以改變腸道菌群的豐度和多樣性，進而誘導與菌群失調相關的毒理學癥狀，最終影響宿主健康. 污染物可以通過動物的“腦—腸—腸道菌群軸”系統雙向調節機制，以菌群代謝產物和衍生物為“信使”，影響內分泌、神經系統的組成和宿主行為. 由于腸道菌群的敏感性及對宿主多種全身性生理功能發育的重要影響，研究污染物對腸道菌群及宿主健康的交互作用已經成為環境毒理學領域的新興熱點.

鑒于微生物菌群的重要作用，目前以美國、日本、加拿大和歐盟為代表的發達國家和地區，在共同完成“人類基因組計劃”(2000年)之后，又戰略部署了一系列支持微生物組相關的研究計劃[14](見圖1). 2006年中國與法國啟動了“中法人體腸道元基因組”合作，隨著歐洲其他國家的加入，該合作已上升為中歐人類微生物組合作[15]. 這些研究計劃能深度解讀微生物群和疾病之間的關聯，為探索環境污染物對腸道菌群產生的毒性效應提供基礎.

圖1 國際上與微生物組相關的研究計劃Fig.1 International research projects related to the microbiome

該文在簡述目前腸道菌群研究方法和環境毒理學進展的基礎上，從組織學、病理學、生理學等角度系統歸納了近年來關于環境污染物對腸道菌群的干擾作用，總結了近年來環境污染物對腸道菌群多樣性和豐富度的影響以及腸道菌群與宿主健康互作機制. 并對腸道菌群毒理學研究中存在的問題和研究方向進行了探討與展望，以期對環境污染物的新型致毒機理研究和環境風險評價提供一定參考.

1 腸道菌群的研究方法

歷史上對微生物組的探索主要限于對致病性菌群的選擇性培養，而多數菌群因為非致病性、種群含量低和培養條件難度大等原因，所受關注較少. 近年來，分析微生物組的方法和標準獲得快速發展，新興技術的發展和應用使得人們可以更加全面地確定腸道菌群的組成，解析菌群的結構和功能. 這使得探索環境污染物與腸道菌群潛在的因果關系、研究相關微生物介導的疾病發生機制成為可能[16-17]. 常用的微生物組分析技術如表1所示，目前高通量測序方法已成為研究環境污染物對腸道菌群影響中最普遍的技術手段.

表1 腸道菌群的研究方法歸納

2 環境污染物對腸道菌群的干擾作用及機制

2.1 環境污染物對腸道菌群的干擾作用

醫用藥物的過度使用以及農藥殘留、重金屬污染、持久性有機污染物、新污染物污染等產生的生態和健康危害已經引起世界范圍內的廣泛研究. 盡管這些環境污染物的毒理學研究已不斷擴展和深入，但是針對腸道微生物開展的環境毒理學研究尚處于起步階段. 一般認為，腸道及腸道微生物系統是經口暴露的污染物進入機體后的第一層暴露接觸點，也是防御污染物毒害作用的第一層屏障[11]. 與機體的其他靶器官相比，腸道微生物更易受到環境污染物的暴露，其變化也能夠直接反映污染物的潛在毒性作用[12-13]. 針對目前廣泛研究的幾種典型環境污染物，該文從污染物種類、應用、環境來源以及對腸道菌群的影響等方面做了歸納整理，以期為進一步開展污染物生態毒理學研究和風險評估提供參考. 由于污染物的生物利用度取決于各種因素，如污染物本身的物理化學特性，與宿主的接觸時間、接觸劑量、宿主自身吸收能力等，該研究進一步整理分析了幾種典型環境污染物在不同暴露濃度、暴露時間下對腸道菌群的影響和對宿主的毒性效應(見表2). 越來越多的研究[23]證明，腸道菌群會受到不同污染物暴露的影響，進而直接或間接對宿主的健康產生影響.

表2 幾種典型環境污染物對不同生物腸道菌群毒理研究歸納

2.2 環境污染物影響腸道菌群和宿主健康的作用機制

環境污染物被人類和動物體內腸道吸收后，通過影響腸道菌群的生理活動，破壞機體腸道屏障，導致腸道組織損傷，進一步引發宿主代謝失調、免疫系統、神經系統、內分泌系統紊亂等多種復雜結果，從而影響宿主健康. 此外，環境污染物通過菌群的介導作用也會增加宿主的易感性，導致炎癥、病原體侵染等，加劇污染物的毒性(見圖2).

圖2 環境污染物暴露影響腸道菌群和宿主健康的潛在作用機制Fig.2 The potential mechanism of environmental pollutants on gut microbiota and host health

2.2.1破壞腸道屏障功能和完整性

腸道菌群在維持宿主腸道完整性和功能上發揮著重要作用：一方面，腸道上皮細胞及部分定植于此的共生微生物菌群構成了保護宿主抵御病原菌侵染的物理性屏障[52-53]；另一方面，腸道菌群可以將食物成分轉化為含吲哚的代謝物，促進潘氏細胞和杯狀細胞分泌防御素、抗菌肽和粘蛋白，以助于維持腸道屏障的完整性[54]. 腸道上皮屏障完整性一旦受到破壞，也會為致病性菌群的移位提供條件，誘發腸道炎癥[55]. 研究[56-57]表明，腸道菌群中的雙歧桿菌、類桿菌等有益菌群產生的短鏈脂肪酸(SCFAs)可以通過多種機制作用于腸道以維持腸道屏障完整性，抑制腸道炎癥. SCFAs通過GPR (如GPR43、GPR109A)信號通路促進腸樹突狀細胞(DC)和Th1細胞分泌白細胞介素(IL-10、IL-18)和AMP，促進調節性T細胞(Treg)的發育，抑制促炎Th17細胞的增殖，促進腸屏障功能的增強. 腸道菌群的代謝物——次級膽汁酸可以通過法尼類X受體(FXR)和纖維母細胞生長因子19(FGF19)調控腸隱窩再生及傷口修復、維持腸道屏障完整性和抑制病原體移位定植[58]. 環境污染物暴露能夠抑制或殺滅有益菌群，改變有益菌群代謝產物(短鏈脂肪酸、次級膽汁酸等)的含量，進而影響代謝產物發揮緩解宿主腸道炎癥、調節腸道屏障的功能. 例如，咪唑作為殺菌劑會造成哺乳動物和水生生物腸道損傷. 暴露于濃度為 1 000 μg/L的咪唑21 d可顯著誘導成年斑馬魚腸道微生物區系失調，有益菌群——擬桿菌屬、另枝菌屬、艾克曼菌屬的豐度均明顯降低，以及腸道粘蛋白分泌紊亂[24]. 口服25、50和100 mg/kg咪唑28 d會誘發小鼠腸道菌群失調和結腸炎癥[59]. 此外，有機磷農藥殺蟲劑毒死蜱可以破壞小鼠腸道屏障完整性，引發炎癥，導致腸道菌群中變形菌門豐度的增加，擬桿菌門豐度的減少[60]. 除了上述污染物外，其他有機污染物如甾體雌激素雌二醇、除草劑阿特拉津同樣也能介導腸道損傷[51].

續表2

腸道菌群是腸道免疫反應的有效刺激因子，在免疫功能中扮演著重要角色[61]. 腸道菌群及其代謝產物通過與免疫系統相互作用，傳遞促進免疫細胞成熟和免疫功能正常發育的神經信號[62]，腸道菌群(擬桿菌、乳桿菌等)可以誘導抗菌肽(AMPs)、免疫球蛋白A (IgA)的表達，從而防御病原體[63]. 腸道菌群通過激活自身表位進而驅動Th1、Th17和調節性T細胞(CD4+、CD25+、Foxp3+)分化、B細胞反應，促進機體對無害抗原的耐受，參與宿主的免疫應答和組織修復[64]. 腸道菌群的代謝產物通過抑制組蛋白去乙酰化酶(HDAC)，并激活GPR41、GPR43、TLR4-TRIF信號通路以促進缺氧誘導因子1α (HIF1α)及芳香烴受體(AhR)、干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的表達，促進細胞因子白介素(IL-6、IL-22、IL-18等)的產生[54,65]，從而調節腸道巨噬細胞的活性，促進病原體清除，維持免疫內環境的穩定和阻止自身免疫疾病的發展. 環境污染物暴露可以通過影響這些有益菌群的增殖進而干擾宿主的免疫系統. 相關研究[66]發現，連續3周對小鼠經口暴露三氯生，能夠通過腸道菌群改變小鼠結腸中免疫細胞和白介素基因(IL-6)的表達，誘導結腸炎. 將小鼠連續暴露于濃度為10、250 μg/L的重金屬砷中,其腸道菌群豐度和多樣性均發生改變，引發微生物中抗砷和亞硝酸鹽還原酶基因表達變化，造成宿主細胞內氧化應激損傷并產生過量的一氧化氮，而氧化應激環境中過量的一氧化氮會影響細胞生長或傳遞異常的信號，進而產生免疫毒性[67]. 另有研究[68]指出，大鼠連續13周暴露于納米銀中會降低厚壁菌門的豐度，并擾亂大鼠回腸中免疫調節基因(TLR2、TLR4、GPR43和FOXp3)的表達，影響大鼠免疫功能和整體穩態.

2.2.2引發代謝失調

短鏈脂肪酸、脂多糖、次級膽汁酸、咪唑丙酸、支鏈氨基酸、吲哚及其衍生物等一系列的菌群代謝產物和衍生物可作為菌群的“信使”，通過激活迷走神經、刺激腸內分泌細胞、傳輸免疫介導信號等途徑作用于大腦，從而對腦細胞(如神經元、少突膠質細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞和內皮細胞)產生細胞特異性的影響[69-70]，影響宿主能量穩態、食欲、胰島素敏感性、內分泌調節等，從而調控宿主代謝[71-72]. 環境污染物可以通過影響腸道微生物而使宿主的代謝產物發生改變. 研究[27]證實，小鼠暴露于低劑量抗生素后，通過改變小鼠體內腸道菌群代謝短鏈脂肪酸的過程，從而影響正常宿主肝臟脂質和膽固醇代謝調節. 小鼠連續4周暴露于重金屬砷(10 mg/L)中會改變腸道內相關菌群的豐度，進而影響宿主正常的脂質、氨基酸、膽汁酸代謝[32]；將小鼠連續暴露于10 mg/L的鎘10周后，腸道內變形菌門、厚壁菌門豐度均顯著降低，血清中脂多糖水平升高并引發肝臟炎癥和能量代謝失調[73]. 相似的研究結論也在水生生物魚類中得到證實：孔雀魚幼魚連續暴露于聚苯乙烯微塑料(粒徑32～40 μm)28 d，魚體腸道中的變形菌豐度顯著增加，參與脂質代謝的放線菌門和浮霉菌門豐度均顯著減少，最終降低了魚體消化、代謝和防御功能[74]. 此外，納米氧化鋅[41]、有機磷農藥二嗪磷[75]及2,3,7,8-四氯二苯并呋喃(TCDF)等多種污染物均可干擾腸道菌群，從而造成宿主代謝紊亂[76].

毒理學研究[30]表明，環境污染物作用于腸道菌群后也能夠改變宿主的生長發育. 菌群產生的SCFAs增加，可刺激腸道內分泌細胞釋放胰高血糖素樣肽-1(GLP1)、空腹肽，同時減少胃饑餓素的分泌，刺激厭食激素的產生，導致宿主食物攝入量顯著減少，對宿主代謝和體重控制發揮重要作用[77]. 將蚯蚓連續28 d暴露于砷(濃度為70～280 mg/kg)后發現，腸道中擬桿菌門豐度增加、鏈霉菌科豐度降低，并伴隨體重下降和死亡率上升的現象[78]. 將黑水虻連續10 d分別暴露于銅(濃度為100～800 mg/kg)和鎘(濃度為10～80 mg/kg)后，觀察到腸道菌群紊亂且體重發育受到抑制[30]. 有研究[27,79]發現，環境污染物暴露能夠通過腸道菌群進一步改變生物體對胰島素的敏感程度，從而導致宿主體重增加. 例如，青霉素等抗生素被小鼠攝入后能夠造成腸道菌群失衡，影響胰島素代謝調節因子和代謝酶基因的異常表達，導致小鼠體內脂肪含量及體重上升. 小鼠在殺蟲劑毒死蜱[60]、重金屬鉛[33]的暴露研究中，也在其體內觀察到了類似的組織生理變化.

2.2.3影響神經行為

近年來，生物和醫學領域的學者深入系統地開展了腸道微生物對生物體神經系統和生物行為的研究，發現腸道菌群及其代謝物能夠作為控制信號分子從腸腔傳輸到迷走神經和腸神經系統，調節GABA和5-HT等神經遞質的濃度，直接或間接地影響神經系統，調控宿主行為[80]. 然而，目前關于污染物通過腸道微生物介導神經行為的毒理學研究還非常有限. 有研究[81]推測，人類的很多精神性疾病可能與污染物暴露影響到腸道菌群有關. 關于該領域的環境毒理學研究還有待進一步深入開展.

3 結論與展望

腸道菌群在維持宿主健康上起著至關重要的作用，也為挖掘環境污染物新的毒性終點和作用機制提供了研究方向. 然而，關于腸道菌群的環境毒理學研究在一些關鍵性科學問題上依然面臨挑戰： ①環境污染物暴露導致的宿主健康損傷與腸道菌群失調常相伴而生，很多研究結果只是證明了二者之間的相關性，在因果關系上依然缺乏系統研究. 這種研究結果上的因果關系缺失，可能為推斷污染物的作用機制帶來困難. ②腸道菌群在不同生物體中存在種間特異性和種內差異性，同一個體在不同的生長發育階段也存在差異. 選擇不同本底值的試驗對象是否會給現有的研究結論造成影響，這也是一個值得關注的問題.

對于這些關鍵問題的闡釋，需要方法學的創新和技術手段的進步. 期待在未來研究中可以在以下兩個方面重點加強方法學的開發和投入： ①開發模式生物，尤其是本底值清晰的生物品系和無菌品系. 對比試驗能夠更加清晰地闡釋腸道微生物的作用，也是破解研究腸道菌群和宿主健康互作因果關系的關鍵. ②開發體外腸道菌群培養技術和腸道模擬系統，通過變量控制，依據“科赫法則”開展腸道菌群穩態形成機制、腸道菌群恢復試驗、環境因子對腸道菌群影響等研究.