自養微生物反硝化法去除沼氣中H 2S工藝研究

董曉瑩，朱 軍，李冰璇，張艷麗，劉昊喆

（1.大連理工大學 盤錦產業技術研究院，遼寧 盤錦 124000；2.阿斯創鈦業（營口）有限公司，遼寧 營口115003；3.遼寧省能源研究所有限公司，遼寧 營口 115003）

0 引言

國家環保標準規定，沼氣中的H2S濃度一般不超過20 mg/m3，如果不對H2S進行處理而直接利用沼氣，將會污染周邊環境，對人類健康造成極大威脅，同時腐蝕設備而縮短其使用壽命[1]～[3]。因此，開發適用于去除沼氣中H2S的技術是十分必要的。

生物脫硫具有許多傳統干法和濕法脫硫所不具備的優勢，如條件易控制、能耗和成本低等。自養微生物反硝化脫硫是以硫化物等無機物充當電子供體，通過氧化無機物質來提供合成細胞所需的能量，并將硝酸鹽作為電子受體完成降解的過程，因為整個過程不需要額外的碳源，所以極大地節約了脫硫成本[4]，[5]。黃聰[6]通過研究發現，單質硫的回收率受到功能微生物豐度和活性的影響。Ramita Khanongnuch[7]研究了缺氧型生物滴濾塔對H2S的脫除效果，并探討了3種瞬時條件（液體流量、H2S負荷率和干/濕間歇操作）對生化脫除反應的影響。Eleni Vaiopoulou[8]開發了煉油廢水生物法脫H2S工藝，該工藝以硝酸鹽為終端電子受體，可將H2S氧化成硫酸鹽。但上述研究均未實現產業化應用，為進一步提高脫硫效果，開發高效、低成本的生物脫硫工藝迫在眉睫。

本研究擬考察在缺氧條件下，硝酸鹽（代替氧氣充當電子受體）對硫化氫的去除效果，從而通過微生物反硝化作用實現氮硫同步脫除的目標。同時，采用響應曲面法對實驗值和響應值進行擬合，繪制各因素相互響應曲面，對單因素進行直觀分析，從而優化微生物反硝化脫硫的條件，為建立高效的天然氣生物凈化工藝，并形成具有自主知識產權的生物脫硫成套技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 培養基的制備

無機鹽液體培養基（馴化液）的制備：分別稱 量NaHCO3，MgCl2和KH2PO4各1 g，0.24 g（NH4）2SO4，1 mL微量元素液，適量的NaNO3和Na2S·9H2O（分別充當氮源和硫源），用蒸餾水充分溶解，再用容量瓶定容至1 L。

微量元素液的制備：分別稱量50 g Na2-EDTA，11 g NaOH，11 g CaCl2·2H2O，3.58 g FeCl2·4H2O，2.5 g MnCl2·2H2O，1.06 g ZnCl2，0.5 g CoCl2·6H2O，0.5 g NH4Mo7O24·4H2O和0.14 g CuCl2·2H2O，用蒸餾水充分溶解，再用容量瓶定容至1 L。

固體培養基的制備：在液體培養基的基礎上加入適量瓊脂。

所有培養基均須在高壓滅菌鍋內121℃下滅菌30 min后備用。

1.2 反硝化脫硫菌種的篩選

取營口污水處理廠二沉池的泥水混合物進行靜置沉淀，取上清液進行稀釋，然后加入馴化液中，不斷提高馴化液的S2-濃度以對功能微生物進行階段性馴化，馴化2周后進行固體平板倍比稀釋，觀察平板上是否有單菌斑的生成。使用接種環將生成的單菌斑接種到含S2-的馴化液中進行擴培，反復進行固液交替純化，直至觀察到固體平板上有外觀一致的單菌斑的生成為止，將篩選到的菌株命名為D-12。經過16S rDNA序列分析鑒定，菌株D-12為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性菌，菌落的形態生理特征為乳白色不透明、橢球狀、菌落平坦、邊緣整齊。

1.3 微生物反硝化脫硫試驗設計

根據沼氣中的H2S含量，利用營養液對沼氣中的H2S吸收處理后，再通過微生物反硝化脫硫作用對S2-進行去除。影響S2-去除的各因素（S2-濃度，NO3-1濃度和微生物添加量）的水平和編碼如表1所示。根據各因素的水平，采用Box-Behnken軟件設計了17組試驗。

表1 各因素的水平和編碼Table 1 The levels and coding of each factor

1.4 微生物反硝化脫硫試驗啟動

用接種環挑單菌斑，接入含有馴化液的三角瓶中，對脫硫反硝化菌進行振蕩培養（試驗溫度為35℃，振蕩速度為150 r/min）1～2周，待馴化液混濁后分別將菌懸液裝入無菌離心管，采用離心機（5 000 r/min）離心20 min后去掉上清液，稱量菌重，之后投入生物滴濾塔濾料中進行掛膜，顯微鏡觀察掛膜成功后用于反硝化脫硫反應。

脫硫反硝化菌的脫硫工藝流程如圖1所示。氣體轉子流量計控制H2S氣體緩慢加入營養液（NaOH+馴化液）中進行化學吸收，之后循環泵和液體轉子流量計控制吸收H2S的營養液循環到生物滴濾塔塔頂，通過噴淋器將營養液均勻噴灑在生物濾料上，以進行反硝化生物脫硫反應。滴濾塔夾層設置循環水浴（35℃），保證微生物菌體的生長繁殖不受溫度波動的影響。

圖1 脫硫反硝化菌的脫硫工藝流程Fig.1 The Desulfurization process flow of desulfurization and denitrification bacteria

1.5 分析方法

采用碘量法測定S2-濃度；采用酚二磺酸比色法測定NO3-濃度；采用pHs25型pH計測定pH值；采用尤尼柯7200型分光光度計測定微生物生長量。

2 結果分析

按響應曲面法優化設計的17組微生物反硝化脫硫試驗的試驗結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計和結果Table 2 Experimental matrix and results for Box-Behnken design

續表2

2.1 NO3-濃度和微生物添加量的影響

從表2可以看出：當S2-濃度為1 750 mg/L，微生物添加量為225 mg/L，NO3-濃度為0時，S2-去除率為32.13%；當其他條件不變，NO3-濃度升高到為1 000 mg/L時，S2-去除率為98.45%。由此可見，NO3-能夠促進S2-的去除，當氧氣供應不足時，硝酸鹽可以替代氧氣作為電子受體，完成生物環境體系中的生化呼吸反應。電子受體有效性是考察還原態硫化物能否被氧化成硫酸鹽或者硫單質的關鍵。有研究表明：當硝酸鹽和硫化物的比例為1.17時，硫化物被氧化為硫酸鹽；當兩者比例為0.29時，硫化物被氧化為單質硫；另外，會有一部分硫化物（10%～11%）在水中溶解氧的作用下發生自氧化[9]。由表2可知，硝酸鹽可以在硫化物氧化反應過程中作為一種有效的電子受體。

當S2-濃度為1 000 mg/L，NO3-濃度為500 mg/L，微生物添加量為75 mg/L時，S2-去除率為82.09%；當其他條件不變，微生物添加量增加到225 mg/L時，S2-去除率為97.36%。由此可見，反應體系中微生物添加量的增加有效提高了S2-的去除率。利用功能微生物的代謝作用可以同步去除S2-和NO3-/NO2-，這是因為當微生物添加量增多時，所需要的底物也隨之增多，反硝化反應的發生也會強化S2-的去除。有研究表明，當反硝化脫硫體系處于堿性條件下或加入沸石時，可將NO3-的去除率提高到95%以上[10]。

2.2 生物降解模型的建立

在菌株D-12反硝化脫硫過程中，采用Box-Behnken設計法對S2-濃度、NO3-濃度和微生物添加量3個因素進行組合優化，得到二次多項式回歸方程預測模型為

Y=92.57-0.011A+33.18B+9.15C-2.46AB+0.18AC+0.35BC+0.79A2-33.07B2-4.68C2

式中：Y為S2-去除率預測值。

表3為預測模型的方差分析結果。由表3可知，試驗結果與預測模型非常吻合，A，B，C及各交互因素BC，A2，B2，C2對S2-去除率影響顯著，說明該模型能夠很好地預測篩選菌株和NO3-協同降解S2-的效果。

模型方程的F值約為351.51，Prob＞F小于0.000 1，即表明該模型是顯著的。模型失擬項的Prob＞F為0.278 5，表明該模型的失擬項并不顯著，說明模型預測擬合效果良好，無失擬因素的干擾，可以用該模型計算得到的預測值來代替實際值進行響應曲面的分析。決定系數R2和校正系數R2adj分別為0.978 0和0.995 0，即該模型的決定系數和校正決定系數不但較高，而且也較為接近，表明該方程擬合程度很好，擬合的響應值和實際值更為一致。

2.3 響應曲面分析

影響S2-去除率的各因素及其相互作用如圖2所示。由圖2（a）可以看出，體系中的微生物添加量越高，越有利于S2-的去除。這是因為微生物添加量越高，微生物分泌的功能酶就越多，所需代謝消耗的底物隨之增多，從而促進了S2-的去除。微生物的正常繁殖代謝是生物濾池高效脫硫反應的關鍵因素。當體系中的S2-濃度為1 000～2 500 mg/L，NO3-濃度為0～1 000 mg/L，微生物添加量為75～225 mg/L時，經過38 d的生物去除，體系中的S2-含量均有所降低，并且當S2-濃度為1 750 mg/L，NO3-濃度為1 000 mg/L，微生物添加量為225 mg/L時，S2-的去除率達到最大值99.45%。由圖2（c）可以看出，NO3-的添加有利于脫硫反應的進行，這是因為在缺氧條件下，NO3-可以代替氧氣作為電子受體，完成生物環境體系中的生化呼吸反應。作為電子受體，NO3-濃度的提高可有效促進S2-的降解，但有報道稱當NO3-的濃度超過1 500 mg/L時，會對環境中的微生物菌體造成毒害作用。綜上可知，當微生物添加量為150～225 mg/L，NO3-濃度為500～1 000 mg/L時，反應體系中的S2-達到了很好的去除效果。

2.4 預測模型的驗證

為驗證最優試驗條件的準確度，在所求的最優試驗參數下進行3組驗證試驗，并將實際的S2-去除率與預測值相比較，具體結果列于表4。由表4可知，S2-去除率的平均值為98.38%，與預測值100%的相對誤差為1.62%，證明該計算模型預測效果良好。

3 結論

試驗篩選出的D-12菌株經過16SrDNA序列分析鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），形態為橢球狀，經革蘭氏鑒定為革蘭氏陰性菌。經過38 d的試驗考察，D-12菌株在兩階段沼氣凈化中表現出了較好的同步反硝化脫硫能力。通過Box-Behnken軟件預測，當S2-濃度為1 258.61 mg/L，NO3-濃度為843.96 mg/L，微生物添加量為219.96 mg/L時，S2-的預測去除率為100%，實測去除率為98.38%，相對誤差僅為1.62%。這表明響應曲面法可簡單高效地優化自養反硝化脫硫實驗條件。此外，在靜態實驗中發現，功能微生物破壁后的無細胞提取液具有更高的S2-降解能力，并發現了較多的單質硫，今后可在固定化酶制劑方面做進一步的研究，以獲得更穩定、高效的S2-去除效果。