磁共振T2- mapping及T2*-mapping對兔腰椎間盤退變的定量研究

熊玉超，曾旭文，梁治平，黃樂平，賈嫵懿

下腰痛(low back pain，LBP)是指后背腰骶部疼痛或不適。在我國下腰痛患者的發病率呈逐年上升的趨勢。成人下腰痛的主要原因是腰椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)[1]。目前臨床上針對椎間盤源性下腰痛的治療方法不能從根本上治療椎間盤退變，而在退變早期恰當干預可避免患者病情逐漸加重，早期發現已經成為其診治的關鍵。臨床上常采用Pfirrmann等[2]提出的椎間盤退變形態學分級方法，這種分級方法屬于一種半定量視覺分級系統，但仍是一種主觀評價方法。T2-mapping及T2*-mapping能夠反映組織的內在特性，能夠提供組織內水含量、膠原纖維排列方式及含量和其它基質結構等方面的信息[3]。已有較多研究肯定了T2-mapping及T2*-mapping技術在分析軟骨組織、椎間盤和其它關節的生物化學和結構改變方面的能力[4-9]。但迄今為止，尚沒有研究同時將IVDD的T2-mapping和T2*-mapping與組織學數據進行比較。本研究通過建立糖尿病兔的椎間盤退變模型，分析不同組織學退變評分的髓核T2和T2*弛豫時間的差異，探T2-mapping及T2*-mapping技術對腰椎間盤退變的診斷價值并分析其與髓核生物化學特征的相關性，旨在為椎間盤退變的早期診斷提供參考。

材料與方法

1.實驗分組及模型的建立

實驗兔隨機分為正常對照組(15只)和糖尿病模型組(15只)。糖尿病模型組和對照組分別按MR掃描時間點隨機均分為3組：1、3和6月組。每只實驗兔在MRI掃描后進行解剖，取L6-7、L7-S1椎間盤進行病理切片。

模型組在造模前均禁食16 h，稱重。在常溫狀態下配置5%的四氧嘧啶溶液，經兔耳緣靜脈一次性快速注射，劑量100 mg/kg；72 h后經兔耳緣靜脈取血，使用快速血糖儀(強生)測量血糖濃度，若隨機血糖>16.7 mmol/L視為造模成功。造模成功后，每周測量試驗兔的隨機血糖來檢測模型的穩定性。

2.MRI方法和參數測量

為減少椎間盤晝夜變化的潛在影響，MRI檢查均在晚上進行。使用Siemens Avanto 1.5T MR掃描儀及8通道膝關節線圈。待兔麻醉后，俯臥固定四肢，頭先進，定位于兩側髂前上嵴連線中心。掃描序列包括矢狀面T2WI、T2-頻率選擇飽和法抑脂技術(spectral presaturation attenuated inversion recovery,SPAIR)、T2-mapping和T2*-mapping。經預實驗后，設定掃描序列及參數如下。T2WI：TR 3500 ms，TE 82 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，視野25 cm×25 cm，矩陣320×240，激勵次數2；T2-SPAIR：TR 3500 ms，TE 88 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，視野32 cm×32 cm，矩陣320×240，激勵次數1；T2-mapping：TE分別為26、52、78、104、130、156、182和208 ms，TR 2200 ms，層厚2 mm，層間距0 mm，矩陣256×256，視野12 cm×12 cm，激勵次數1；T2*-mapping：TE分別為4.06、13.03、21.29、29.55和37.81 ms，TR 468 ms，層厚2.5 mm，層間距0 mm，矩陣256×256，視野12 cm×12 cm，激勵次數1。

掃描后將DICOM格式的各序列圖像導入MIPAV后處理軟件。首先在T2及T2*圖像上選取椎間盤顯示最佳的圖像，利用MIPAV軟件的Draw levelset ROI功能追蹤呈相對高信號區的椎間盤，再利用Smooth ROI功能對選擇區域進行處理，使選擇的ROI變成類橢圓形，ROI的面積為椎間盤面積的1/4，保證ROI位于椎間盤的髓核組織中。最后利用calculate statistics on ROI和Exclude pixels from cal-culate功能去除圖像噪聲并獲得ROI的平均T2值及平均T2*值(圖1)。

圖1 ROI選取示意圖。a)腰椎間盤T2*-mapping圖；b)選取L6-7椎間盤，利用 MIPAV軟件的Draw levelset ROI功能追蹤相對高信號區，勾畫出不規則形的ROI；c)利用Smooth ROI功能對所勾畫的ROI進行處理，使ROI變成類橢圓形。

3.病理檢查方法

HE染色：由一位研究生和一位病理科醫師按照Masuda等[10]提出的髓核組織學退變分級量表(表1)，對HE染色的椎間盤切片進行髓核組織學退變評分，如兩者的意見不一致，則由另外一位病理科醫師參與評估。髓核組織學退變評分為髓核細胞與髓核基質的評分相加，評分范圍為2～6分，2分為正常椎間盤， 3、4分為早期椎間盤退變，5、6分為晚期椎間盤退變。

表1 髓核組織學退變評分量表

番紅O-固綠染色：番紅O是一種結合多陰離子的陽離子染料，與多糖中陰離子基團結合。番紅O著色與陰離子的濃度近似成正比關系，間接反映了基質中蛋白多糖的含量和分布。當椎間盤退變時，髓核基質中的蛋白多糖丟失，從而導致番紅O淡染或者不著色。

4.統計分析

所有數據使用SPSS 21.0軟件進行統計分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。采用單因素方差分析比較不同組織學評分之間髓核T2和T2*值的差異，多組數據間的兩兩比較采用Tukey法(方差齊性)或者Tamhane's法(方差不齊)；采用Spearman相關分析評估T2值、T2*值與髓核組織學退變評分的相關性。|r|>0.7為相關性強，|r|=0.5～0.7為相關性中等，|r|<0.5為相關性弱。

結 果

1.HE和番紅O-固綠染色

HE染色反映細胞形態的變化，而番紅O-固綠染色主要反映細胞外基質內蛋白聚糖的含量及分布情況。本組研究結果顯示，隨著退變的進展，髓核細胞減少和髓核細胞空泡減小，髓核基質凝結，髓核基質染色程度逐漸降低(圖2)。

圖2 HE和番紅O-固綠染色圖像。a) 髓核組織學退變評分為2分的HE染色切片，髓核細胞呈多角性，在基質凝膠狀結構中有大的空泡,髓核基質呈正常凝膠狀結構，未見分層和裂隙；b) 髓核組織學退變評分為4分的HE染色切片髓核細胞數量輕度減少，空泡輕度減少,髓核細胞外基質輕度皺縮；c) 髓核組織學退變評分為6分的HE染色切片,髓核細胞數量重度減少,髓核細胞周圍未見空泡,髓核細胞外基質重度皺縮; d～f) 分別代表髓核組織學退變評分為2、4、6分的番紅O-固綠染色圖像；d) 髓核基質染色深且清晰；e) 髓核基質染色程度降低僅個別區域染色較深；f) 髓核基質染色程度明顯降低。

2.組織學退變評分

模型組和對照組共計30只兔子60個椎間盤，兩組之間髓核組織學評分的比較結果見表2。髓核組織學退變評分為2分的椎間盤共14個，3分共22個，4分共10個，5分共6個，6分共8個。模型組與對照組之間髓核組織學退變評分的差異具有統計學意義(Z=16.81，P=0.001)。

表2 對照組與模型組髓核組織學評分的比較 /個

3.不同組織學退變評分髓核T2值比較

組織學退變評分為2～6的髓核T2和T2*值測量結果見表3。隨著組織學退變評分的增加，髓核T2和T2*值逐漸減小(圖3～4)。

圖3 L6-7和L7-S1椎間盤T2-mapping偽彩圖與解剖結構圖像的融合圖，a～e圖上髓核組織學退變評分分別為2～6分(L6-7和L7-S1椎間盤內髓核的組織學退變評分一致)。 圖4 L6-7和L7-S1椎間盤T2*-mapping偽彩圖與解剖結構圖像的融合圖，a～e圖上髓核組織學退變評分分別為2～6分(L6-7和L7-S1椎間盤內髓核的組織學退變評分一致)。

表3 不同組織學退變評分的髓核T2和T2*值

單因素方差分析結果顯示，不同組織學退變評分之間髓核T2值的差異有統計學意義(F=101.16，P<0.01)。進一步組間兩兩比較，2分組與4、5、6分組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)； 3分組與4、5、6分組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；4分組與5、6分組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而2分組與3分組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；5分組與6分組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。髓核組織學退變評分與T2值呈高度負相關(r=-0.794，P<0.01)。

4.不同組織學退變評分髓核T2*值比較

不同組織學退變評分組之間髓核T2*值的差異有統計學意義(F=24.13，P<0.01)。進一步組間兩兩比較結果見圖6。其中，2分組與5、6分組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；3分組與5、6分組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；4分組與5、6分組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；5分組與6分組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；而2、3、4分組之間兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。髓核組織學退變評分與T2*值呈中度負相關(r=-0.615，P<0.01)。

討 論

T2-mapping和T2*-mapping作為軟骨磁共振成像的新技術，最早用于評價四肢關節軟骨退變的生物化學改變，近年來國內外已成功應用T2-mapping和T2*-mapping技術對關節軟骨病變進行早期診斷[8,11]。椎間盤組織的生物化學成分與關節軟骨相似。T2-mapping和T2*-mapping用于定量評估腰椎間盤退變的效果已在既往的研究中得到了證實[12-14]，但大部分研究僅僅將T2-mapping和T2*-mapping與Pfirrmann分級或者Thompson分級進行對比，并未獲得組織病理學的證實。

本研究結果顯示，髓核組織學退變評分與T2值呈強負相關關系，即使在髓核組織學評分為3和4分時，兩組間T2值的差異也具有統計學意義(P<0.05)。這與Chai等[15]和Gullbrand等[16]的研究結果一致，提示髓核的T2值具有識別早期椎間盤退變的能力。本研究結果還顯示隨著髓核組織學退變評分的升高，蛋白多糖(proteoglycan，PG)的染色程度也逐漸降低，這是由于在椎間盤退變的過程中，最早和最主要的變化是糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)減少。GAG是PG的主要成分，主要影響椎間盤的高含水量和膨脹壓力，GAG的減少將會引起椎間盤細胞外基質含水量降低，進而導致T2值降低。Gullbrand等[16]使用離體木瓜蛋白酶消化誘導椎間盤退變模型，將兔椎間盤機械和生化特性的變化與T2值相關聯，結果也發現GAG的含量有重要作用。但Marinelli等[3]對人尸體研究發現，T2值與髓核含水量顯著相關(r=-0.81，P<0.01)，與PG(r=-0.57，P<0.01)含量相關性較弱。作者認為這可能是由于尸體標本數較少，且尸體標本經歷了多次解凍和冷凍循環，導致線性回歸結果不準確。

椎間盤退變的病理改變還包括各型膠原纖維的變化，主要是Ⅰ型膠原纖維持續上升，Ⅱ型膠原逐漸下降，且改變主要發生在退變晚期。椎間盤各型膠原纖維的變化可能也會影響T2值。Sun等[17]發現就研究發現T2值不僅與PG基因表達(r=-0.85)具有顯著相關性，而且還與Ⅱ型膠原纖維基因的表達水平(r=0.78)具有較高的相關性，這可能是由于Ⅱ膠原纖維改變可導致GAG減少，GAG減少導致髓核內水分丟失，T2值減小，也可能是由于各型膠原纖維改變本身就會導致T2值降低，具體機制目前尚不明確，有待進一步研究。

綜上可知，T2-mapping成像可以無創檢測髓核GAG和水分含量的變化，而椎間盤退變早期最主要的變化是GAG和水分丟失[13,18-20]，因此T2-mapping可以通過測定T2值發現無明顯形態學改變的早期椎間盤退變，為診斷早期椎間盤退變提供重要的參考依據并指導臨床早期干預。但T2-mapping在檢測髓核Ⅱ型膠原纖維變化方面的價值尚存在爭議。

本研究結果顯示，髓核組織學退變評分與T2*值呈中度負相關，這與Detiger等[21]的結果基本一致。本研究結果還顯示髓核組織學退變評分2、3、4分之間T2*值的差異無統計學差異(P>0.05)，這與Welsch等[12]和Detiger等[21]發現Pfirrmann分級Ⅰ級與Ⅱ級之間T2*值的差異無統計學意義的結果相一致，表明與T2-mapping比較，T2*-mapping在診斷早期椎間盤退變的價值較低。作者認為可能由以下幾個原因導致：①以上研究中T2*-mapping成像選擇的回波時間短于計算的T2*值，這可能導致實際T2*測量值偏低，從而影響與椎間盤組織退變評分相關性的分析結果；②額外的去相位效應干擾了T2*值對髓核生物化學改變的反映能力。Hoppe等[13]認為T2*-mapping成像可以定量評價早期椎間盤退變GAG和水含量的變化，郭智萍等[22]發現髓核T2*值與Pfirrmann分級呈強負相關，上述研究者均認為T2*-mapping在診斷早期椎間盤退變具有較高的價值，與本研究結果不一致，這與以上研究中均以常規MRI分級標準作為參考標準，沒有獲得組織病理學結果有關。

另外，本研究結果顯示髓核組織學退變評分5、6分之間T2*值的差異有統計學意義(P<0.05)，這可能是由于髓核組織學退變5分與6分之間的主要差別在于髓核外基質的凝結程度不同，導致纖維結構紊亂程度明顯不同，從而導致其T2*值出現顯著差異。T2*-mapping成像可能在膠原纖維組織的識別中具有潛力，如Detiger等[21]研究發現前纖維環與后纖維環T2*值的差異有統計學意義，推測在脊椎抵抗屈伸和旋轉等運動負荷的能力時，后纖維環受到更多的應力，導致膠原纖維結構紊亂，從而導致T2*值降低；Zhang等[23]研究中也發現Pfirrmann Ⅰ級與Ⅱ級之間椎間盤纖維環的T2*值具有顯著差異。但由于本研究中采用兔子來建立椎間盤退變模型，其椎間盤的纖維環較小，測量會存在較大誤差，因此未對纖維環T2*值的變化進行探討，還有待今后進一步完善。綜上可知，T2*-mapping可以在一定程度上定量評估椎間盤退變，但是T2*值與髓核組織學評分、常規MRI分級之間的相關性強弱尚存在爭議，其在診斷早期椎間盤退變的價值也有待進一步探究。此外，諸多研究認為T2*-mapping成像在識別膠原組織結構改變方面具有較大的潛力。

在本研究中，T2值(r=-0.794，P<0.01)的相關性高于T2*值(r=-0.615，P<0.01)，提示T2-mapping較T2*-mapping對椎間盤退變的等級判斷更加敏感。本研究結果顯示，髓核組織學退變評分2分與4分、3分與4分之間T2值的差異有統計學意義，而T2*值的差異均無統計學意義，提示T2-mapping成像在早期椎間盤的診斷中具有較高的價值。髓核組織學評分5分與6分之間T2值的差異無統計學意義，而T2*值的差異有統計學意義，提示T2*-mapping可能在識別椎間盤纖維化程度方面具有較高的診斷價值。T2-mapping和T2*-mapping均可以提供可靠的椎間盤退變的生物化學改變信息。相比于T2*-mapping，T2-mapping在評估早期椎間盤退變中具有更高的價值，但是T2*-mapping較T2-mapping具有掃描時間短、圖像信噪比高和空間分辨率高等優點[12]。T2和T2*值依賴于微觀組織結構的改變，更容易受磁敏感效應的影響[24]。

本研究尚有一些不足之處：僅選取了正中矢狀面這一個層面進行數據測量，而每只兔子以及每個椎間盤在接近中線區域的形態和成分可能不一樣，最后得到的T2和T2*值可能會有偏倚；使用了HE染色和番紅O-固綠染色觀察髓核細胞及其基質的情況，尚需進一步在電鏡下觀察細胞超微結構和進行免疫組化分析，進一步分析T2和T2*值與MRI表現的關系。