HPLC法測定復方氨酚美沙糖漿中對氨基酚含量

蔡錦雄，江 坤，陳顏清，劉 敏，李玉蘭

（深圳市藥品檢驗研究院/深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057）

復方氨酚美沙糖漿為復方制劑，含有對乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬、鹽酸甲基麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚和馬來酸氯苯那敏5 個藥物活性成分，臨床用于普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱、頭痛、四肢酸痛、打噴嚏、流鼻涕和咳嗽等癥狀。處方中對乙酰氨基酚用量較大，在《中國藥典》[1]2020 年版（二部）中，含對乙酰氨基酚的品種，控制的主要雜質(zhì)均有對氨基酚。對氨基酚毒性較大，其主要來源為合成過程中的原料殘留或貯藏過程中降解產(chǎn)生[2，3]，而復方氨酚美沙糖漿的現(xiàn)行標準[4]中，未對其進行控制。本文參考《中國藥典》對乙酰氨基酚品種相關方法，建立了高效液相色譜法測定復方氨酚美沙糖漿中對氨基酚含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695-2998 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XS205DU 電子天平（瑞士梅特勒公司），UW620H 電子天平（日本島津公司）；Milli-Q Reference 純水器（德國默克密理博公司）。

1.2 材料 對氨基酚對照品（中國藥品檢驗研究院，批號100802-201604，含量100%）；乙酸銨（阿拉丁，阿拉丁，批號C1915017），甲醇（色譜純，德國默克公司，批號I1095607022）；復方氨酚美沙糖漿（國內(nèi)某公司，批號19111712、19111812、19111912）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為0.05 mol/L 醋酸銨溶液，流動相B 為甲醇，按表1 進行梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μl；檢測波長為231 nm。

表1 HPLC 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 取對氨基酚對照品15 mg，精密稱定，至100 ml 量瓶中，加溶劑0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（90∶10）使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，至50 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液制備 用內(nèi)容量移液管精密量取本品1 ml，置5 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 靈敏度溶液制備 精密量取對照品溶液1 ml，置10 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 分離度溶液制備 精密量取等量對照品溶液和供試品溶液，混合均勻。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別取分離度溶液和靈敏度溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。結果顯示，在分離度溶液中，對氨基酚的保留時間約為4.9 min，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于5.0，理論板數(shù)為8108，拖尾因子為1.5；在靈敏度溶液中，對氨基酚峰的信噪比為24。

圖1 分離度溶液色譜結果

2.4 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖2，結果顯示空白溶劑對測定無干擾。

圖2 專屬性試驗結果

2.5 線性關系試驗 精密稱取對氨基酚對照品約15 mg，加溶劑并稀釋制成濃度為0.30～15.18 μg/ml 的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸。結果顯示，對氨基酚在0.30～15.18 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為y=72270.4x-983.8，相關系數(shù)r=1.000。

2.6 準確度試驗 精密量取本品（批號19111712）1 ml，置5 ml 量瓶，分別加入濃度為15 μg/ml 對氨基酚溶液0.8、1.0 和1.2 ml，加溶劑稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件進行測定，依法計算回收率，結果顯示，平均回收率為100.30%，RSD 為0.90%（n=9）。

2.7 重復性試驗 本品（批號19111712）6 份，按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示，6 份供試品溶液均未檢出對氨基酚峰，方法重復性良好。

2.8 檢測限及定量限試驗 取“2.5”線性溶液依法稀釋，作為檢測限和定量限溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示，對氨基酚的檢測限為0.1 μg/ml（0.002%），定量限為0.2 μg/ml（0.005%）。

2.9 耐用性 取3 根不同型號的色譜柱（Agilent SB C18、WatersXBridgeC18 和Kromasil 100-5C18，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm），在3 臺不同品牌儀器上，按“2.1”項下色譜條件進行測定系統(tǒng)適用性溶液，結果見表2。結果顯示該法耐用性良好。

表2 耐用性結果

2.10 穩(wěn)定性 取對照品溶液，在樣品倉溫度為15 ℃條件下，連續(xù)考察12 h，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示，對照品溶液隨著時間的推移，對氨基酚峰峰面積逐漸減小，在3 h 內(nèi)穩(wěn)定，溶液需臨用新制。

2.11 樣品測定 取3 批樣品，按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示3 批樣品均為檢出對氨基酚峰。

3 討論

液相色譜方法的確定高效液相色譜法的基本原理是在高壓力下，利用不同組分與固定相和液體流動相作用力不同，實現(xiàn)分離的色譜方法。目前已成為藥物分析與藥品檢驗的主流分析方法[5]。復方氨酚美沙糖漿為復方抗感冒藥品，其處方中具有解熱鎮(zhèn)痛的對乙酰氨基酚組分含量最高，而對氨基酚為對乙酰氨基酚的主要雜質(zhì)，且該雜質(zhì)毒性較大[6，7]，需進行控制。故建立了高效液相色譜法測定復方氨酚美沙糖漿中的對氨基酚含量。

流動相系統(tǒng)選擇在《中國藥典》2020 年版二部中，對氨基酚的檢查項下，流動相系統(tǒng)主要有磷酸鹽（含四丁基氫氧化銨）-甲醇系統(tǒng)、磷酸鹽（pH4.5）-甲醇系統(tǒng)、醋酸銨-甲醇系統(tǒng)和辛烷磺酸鈉（pH3.0）-乙腈系統(tǒng)。經(jīng)考察，在0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（85∶15）系統(tǒng)中，對氨基酚峰峰型良好，與相鄰色譜峰分離較好。但對氨基酚峰出峰較早，且本品處方組成復雜，右美沙芬等在該系統(tǒng)中保留能力較強，故將起始流動相優(yōu)化為0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（90∶10），使對氨基酚峰出峰時間更適宜，并將系統(tǒng)進一步優(yōu)化為梯度系統(tǒng)，使方法準確性和耐用性等更佳。

檢測波長選擇采用二極管陣列檢測器，考察對氨基酚對照品溶液和加標供試品溶液，其對氨基酚峰的3D 圖譜顯示，在231、297 nm（或298 nm）有最大吸收峰，其中，231 nm 吸收峰強度更高，且在該波長下，無其他色譜峰干擾，故選擇測定波長為231 nm。

溶劑的選擇查看《中國藥典》2020 年版二部測定對氨基酚的該流動相體系，溶劑均采用流動相，經(jīng)進一步試驗，使用0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（90∶10）作為溶劑時，對氨基酚對照品和供試品溶液均能完全溶解，且方法學驗證結果顯示，該溶劑滿足試驗要求。

綜上所述，本試驗中采用高效液相色譜法測定復方氨酚美沙糖漿中對氨基酚的含量，方法操作簡單、靈敏、結果準確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。