HPLC法測(cè)定復(fù)方大紅袍止血膠囊中沒(méi)食子酸的含量

覃媛媛，沈嘉華

（楚雄州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 楚雄 675000）

復(fù)方大紅袍止血膠囊（compound dahongpao zhixue capsules）為云南龍發(fā)制藥股份有限公司獨(dú)家品種，是由大紅袍、柿蒂兩味中藥材經(jīng)提取制成的彝藥制劑，功效為收斂止血，用于功能性子宮出血、人工流產(chǎn)術(shù)后出血、放取環(huán)術(shù)后出血、鼻衄、胃出血及內(nèi)痔出血等（彝醫(yī)功能主治稱(chēng)為差嫫且凱斯多，斯開(kāi)色土，卑開(kāi)塞嘟）。復(fù)方大紅袍止血膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為局頒標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)WS-10364-2002-2011Z），制定有大紅袍的薄層鑒別和鞣質(zhì)的容量法含量測(cè)定。本研究中通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）對(duì)大紅袍和柿蒂中均含有的沒(méi)食子酸進(jìn)行含量測(cè)定，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供重現(xiàn)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)的檢驗(yàn)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司；檢測(cè)器：DAD）；賽多利斯BT125D（0.01 mg）電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；梅特勒MS304 TS/02（0.1 mg）電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ELGA 超純水機(jī)（法國(guó)威立雅公司）。

1.2 試藥 沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)111703-201504，含量90.8%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方大紅袍止血膠囊（云南龍發(fā)制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為 171104、180105、180509、180908、181001、190102、190103、190104、190105、190106）；陰性對(duì)照樣品由云南龍發(fā)制藥股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液（5∶95）；檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl；理論板數(shù)以沒(méi)食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于7000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品10.09 mg置100 ml 量瓶中，加5%鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，精密量取5 ml 置50 ml 量瓶中，加5%鹽酸溶液稀釋至刻度，即得沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為9.1617 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入5%鹽酸溶液50.00 ml，稱(chēng)定重量，置水浴中回流水解4 h，放冷，用5%鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重置，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取不含大紅袍藥材、不含柿蒂藥材、不含大紅袍和柿蒂藥材的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品在與沒(méi)食子酸對(duì)照品主峰保留時(shí)間相應(yīng)的位置上有相同色譜峰出現(xiàn)，且主峰與相鄰色譜峰能完全分離，峰形良好，理論板數(shù)能達(dá)到7000，陰性樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

圖1（續(xù)）

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、10、20、30 μl，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得沒(méi)食子酸的回歸方程（n=6）為：Y=3150X-1.789，r2=1.0000，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸在1.832～27.485 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，平均峰面積為285.55496，RSD 為0.06%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：190101）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，平均含量為0.5963 mg/g，RSD 為1.86%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液和同一批樣品（批號(hào)：190101）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、16、12、32、48 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液和供試品溶液沒(méi)食子酸峰面積RSD 分別為0.38%和1.21%，結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量的復(fù)方大紅袍止血膠囊（批號(hào)：190101）內(nèi)容物6 份，0.5 g/份，精密加入相當(dāng)于樣品中所含沒(méi)食子酸量100%的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定 取樣品10 批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算10 批樣品中沒(méi)食子酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/粒）

3 討論

3.1 HPLC 成分確定 《中國(guó)藥典》2015 年版一部[1]“柿蒂”薄層鑒別項(xiàng)下以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，國(guó)內(nèi)外亦有文獻(xiàn)報(bào)道柿蒂中含有沒(méi)食子酸[2，3]，雖未查詢(xún)到文獻(xiàn)表明大紅袍含有沒(méi)食子酸，但通過(guò)對(duì)原藥材的檢測(cè)表明其含有該成分。沒(méi)食子酸具有較強(qiáng)的抗炎抗氧化作用，能抑制腫瘤形成，同時(shí)能通過(guò)抑制內(nèi)皮NO 的生成降低血管松弛，從而起到止血作用[4，5]，故本研究將沒(méi)食子酸選定為含量測(cè)定目標(biāo)成分。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本文研究對(duì)沒(méi)食子酸進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在215 nm 和272 nm 波長(zhǎng)處均有吸收，結(jié)合紫外響應(yīng)值大小、色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)尖銳、陰性無(wú)干擾等條件，選擇272 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本研究觀察了乙腈-水、乙腈-不同濃度磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-不同濃度磷酸溶液等多種不同配比流動(dòng)相對(duì)組分分離、保留時(shí)間的影響，結(jié)果表明甲醇-水（5∶95）為最佳流動(dòng)相，能使被測(cè)成分與其它成分較好的分離，峰形好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.4 提取方法的選擇 參考《中國(guó)藥典》2015 年版一部[1]中“五倍子”“地榆”“余甘子”“腸炎寧片”“宮炎平片”含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液制備方法，考察了不同溶劑（4 mol/L 鹽酸溶液、5%鹽酸溶液、50%甲醇、甲醇），不同提取方法（超聲、加熱回流），不同提取時(shí)間（3、4、5 h）的提取效果，最終確定5%鹽酸溶液加熱回流4 h 為最佳提取方法。

3.5 耐用性考察 本研究對(duì)不同廠家、型號(hào)色譜柱（色譜柱A：Agilent SB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；色譜柱B：Agilent 5 HC-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；色譜柱C：Thermo AcclaimTM 120-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm 和色譜柱D：Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm），不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃），不同流速（0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min）進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果表明文中確定的色譜條件對(duì)色譜峰峰形、分離度、理論塔板數(shù)影響性不大，耐用性較好。

綜上所述，復(fù)方大紅袍止血膠囊是一個(gè)療效確切、使用廣泛的彝藥制劑，其檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)最早收載于《國(guó)家藥品中藥標(biāo)準(zhǔn)》（外科、婦科分冊(cè)），與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)方法一致，其含量測(cè)定均用絡(luò)合滴定法測(cè)定總鞣質(zhì)含量，本次研究制定的HPLC 法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于復(fù)方大紅袍止血膠囊的質(zhì)量控制。