應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌移植瘤小鼠脾臟中MDSC及T淋巴細(xì)胞亞群的變化

李 南，曾凡業(yè)，仝夢婷，節(jié)陽華，軒艷紅，張洪亮

（新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤二科，新疆 烏魯木齊 830000）

胃癌（gastric cancer）是消化道最常見的惡性腫瘤，其死亡率約占所有癌癥死亡率的20%～30%，一般患者的5 年生存率小于20%，且大多預(yù)后較差[1]。目前胃癌的致病機(jī)制尚不明確，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞可能通過促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡或抑制其功能從而獲得免疫逃逸。傳統(tǒng)治療方案如手術(shù)、放療及化療未能明顯改善患者的預(yù)后生存，但隨著對胃癌生物分子學(xué)機(jī)制的不斷深入研究，腫瘤免疫治療可能為胃癌治療方案提供新的思路。髓性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）是一種異質(zhì)性細(xì)胞，主要來源骨髓組細(xì)胞和未成熟髓細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)[2，3]，大量MDSC 積聚在荷瘤小鼠脾臟、血液及腫瘤組織或存在腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中。正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)是機(jī)體抵抗腫瘤細(xì)胞形成和發(fā)展的重要保護(hù)因素，其中CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)尤為突出。在腫瘤微環(huán)境中，活化的MDSC 可通過直接或間接作用發(fā)揮免疫抑制作用，產(chǎn)生免疫逃逸反應(yīng)，從而使腫瘤逃避機(jī)體的自身免疫監(jiān)視體系，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[4]。本研究建立小鼠胃癌皮下移植瘤模型，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測荷瘤小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞以及MDSC 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的數(shù)量及相關(guān)比例變化，并分析其相關(guān)T 淋巴細(xì)胞的增值和凋亡反應(yīng)，探討MDSC 在胃癌免疫逃逸中可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6～8 周齡C57BL/6J 小鼠30只，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[許可證號：scxk（京）2019-0011]，在新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠前胃癌細(xì)胞株（mouse forestomach carcinona cell，MFC）購自于中科院上海生命科學(xué)院。

1.1.3 儀器及試劑 紅細(xì)胞裂解液，F(xiàn)c 受體阻斷劑（2.4G2），相關(guān)流式抗體（BV421 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD25；BV605 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD8a；Alexa FluorTM647 標(biāo)記大鼠抗小鼠；Foxp3 APC-cy7 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD11b。FITC 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4；PE 標(biāo)記大鼠抗小鼠Gr-1；PE-cy7 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD3），活力染料FVS510，熒光補(bǔ)償微球及膜聯(lián)蛋白-V（Annexin-V）凋亡染色試劑盒、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒均購自美國BD bioscience 公司。流式細(xì)胞儀為CytoFLEX 和流式數(shù)據(jù)分析軟件為Kaluza 2.0 均購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 造模消化 收集對數(shù)生長期的MFC 細(xì)胞，PBS洗滌2 次后，用PBS 制成細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞比例大于95%，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。采用隨機(jī)數(shù)字表法將30 只小鼠分成正常組和荷瘤組，每組15 只。對小鼠右側(cè)背部皮膚進(jìn)行常規(guī)酒精消毒后，荷瘤組小鼠注射取0.2 ml 的MFC 細(xì)胞懸液，正常組小鼠注射等量的生理鹽水。

1.2.2 免疫細(xì)胞表面抗原染色 腫瘤形成約2 周后采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離脾臟并將其制成單細(xì)胞懸液，加入Fc 受體阻斷劑2.4G2，4 ℃下封閉10 min，然后加入活力染料FVS510（1∶1000 稀釋），室溫下孵育15 min。用細(xì)胞緩沖液洗滌2 遍后加入滴定的細(xì)胞表面抗體混合液，總反應(yīng)體系為50 μl，4 ℃下避光孵育10 min，細(xì)胞緩沖液清洗兩遍后上機(jī)檢測。采用FMO 作為陰性對照，細(xì)胞凋亡檢測按照說明書操作。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)染色 制備脾臟單細(xì)胞懸液，在進(jìn)行細(xì)胞表面抗原染色后，染色緩沖液洗滌2 次后，加入100 μl 細(xì)胞固定/打孔液，混勻后4 ℃下避光放置20 min。2 次細(xì)胞固定/打孔緩沖液洗滌后，用100 μl細(xì)胞固定/打孔緩沖液重懸后，加入滴定的Foxp3 抗體，4 ℃下避光孵育30 min。細(xì)胞固定/打孔緩沖液洗滌2 次后上機(jī)檢測。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測 小鼠24 h 腹腔內(nèi)注射BrdU 溶液，1 mg/只，連續(xù)注射3 d。在處死小鼠制成脾臟單細(xì)胞懸液后，先進(jìn)行細(xì)胞表面染色，細(xì)胞經(jīng)固定，破膜后加入DNase（1×107/ml），37 ℃下避光孵育60 min，加入熒光素標(biāo)記的BrdU 單克隆抗體染色，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。將α=0.05 設(shè)為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌MFC 荷瘤小鼠腫瘤形成情況 胃癌移植瘤接種小鼠后，第6 天可在體外觸及約黃豆大小腫塊，約第17 天后腫塊顯著增大，其與正常組小鼠相比，荷瘤組小鼠開始出現(xiàn)不同程度的消瘦、豎毛、蜷縮、精神萎靡、懶動(dòng)、活動(dòng)量減少，成瘤率為100.00%。

2.2 荷瘤小鼠脾臟中MSDC 和Treg 細(xì)胞變化 在流式數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)用4 個(gè)基本的二維散點(diǎn)圖以消除上樣分析樣本的碎片、死細(xì)胞，粘連體和不穩(wěn)定的細(xì)胞流見圖1。與正常組相比，荷瘤組MDSC 占脾細(xì)胞的比例和數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；荷瘤組CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例及數(shù)量較正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表1。

表1 兩組小鼠脾臟中MDSC 和Treg 細(xì)胞比例及數(shù)量比較（）

表1 兩組小鼠脾臟中MDSC 和Treg 細(xì)胞比例及數(shù)量比較（）

圖1 粘連體和不穩(wěn)定的細(xì)胞流

圖2 小鼠脾臟中MDSC 和Treg 細(xì)胞

2.3 荷瘤小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞變化 荷瘤組小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞所占脾細(xì)胞比例和數(shù)量低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 兩組小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞比例及數(shù)量比較（）

表2 兩組小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞比例及數(shù)量比較（）

圖3 小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞

2.4 荷瘤小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞凋亡率與增值率變化 荷瘤組CD4+T 細(xì)胞凋亡率高于正常組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；荷瘤組小鼠脾臟CD8+T 細(xì)胞凋亡比例高于正常組，且CD4+和CD8+T細(xì)胞增值率低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、表3。

表3 兩組小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞凋亡率與增值率比較（，%）

表3 兩組小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞凋亡率與增值率比較（，%）

圖4 小鼠脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞凋亡率與增值率

3 討論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展常伴隨著機(jī)體自身的免疫功能異常變化，且主要體現(xiàn)在各種功能性免疫細(xì)胞數(shù)量或功能的改變。體內(nèi)多種免疫細(xì)胞可殺傷或清除腫瘤細(xì)胞，但傳統(tǒng)T 細(xì)胞仍發(fā)揮著至關(guān)重要作用，其中CD8+效應(yīng)性T 細(xì)胞可釋放穿孔素或顆粒酶，分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）及表達(dá)膜型FasL 等機(jī)制直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而CD4+效應(yīng)性T 細(xì)胞可釋放Th1 型細(xì)胞因子，促進(jìn)CD8 的細(xì)胞毒性殺傷機(jī)制[5]。然而，在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中，腫瘤細(xì)胞卻能逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊或抑制傳統(tǒng)T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行性生長。MDSC和Treg 細(xì)胞可發(fā)揮免疫抑制作用，其中人MDSC 定義為CD33+CD11b+HLA-DRlow/-，小鼠MDSC 定義為Gr1+CD11b+[6]，而Treg 是一群細(xì)胞表面高表達(dá)CD25，胞內(nèi)高表達(dá)Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子的CD4+T 細(xì)胞亞群。腫瘤部位的MDSC 可分泌白介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抑制免疫應(yīng)答，而Treg細(xì)胞可通過細(xì)胞直接接觸和分泌IL-35 和TGF-β等細(xì)胞因子抑制T 效應(yīng)細(xì)胞增殖[7，8]。

MDSC 是免疫抑制網(wǎng)絡(luò)中主要的細(xì)胞群，其是由早期髓源祖細(xì)胞、非成熟粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及不同分化階段的樹突狀細(xì)胞組成，可存在于腫瘤患者外周血和大量積聚在荷瘤宿主外周淋巴和腫瘤組織中[6]。本研究采取MFC 小鼠背部注射制備胃癌小鼠模型，主要觀察荷瘤小鼠脾臟中各種淋巴細(xì)胞的變化，結(jié)果顯示荷瘤小鼠脾臟中MDSC 和Treg 細(xì)胞較正常組升高，而CD4+和CD8+T 細(xì)胞比例和數(shù)量卻呈下降趨勢（P＜0.05），其原因可能為這兩類淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯降低，且CD8+T 細(xì)胞的凋亡能力顯著升高。此外，MDSC 的大量增殖和激活能誘導(dǎo)一氧化氮合酶，精氨酸酶和活性氧的表達(dá)，從而導(dǎo)致精氨酸的加速分解和一氧化氮的大量合成，而精氨酸的缺乏會(huì)阻滯T 細(xì)胞的分化和增殖，且一氧化氮的積聚會(huì)抑制IL-2 受體下游信號蛋白，從而抑制T 細(xì)胞活化，并激活Fas-FasL 途徑促進(jìn)T 細(xì)胞凋亡[9，10]。此外，CD8+T 細(xì)胞Fas 表達(dá)的增加，也會(huì)增強(qiáng)腫瘤組織MDSC 和Treg 誘導(dǎo)凋亡的敏感性。

總之，胃荷瘤小鼠脾臟中MDSC 和Treg 細(xì)胞比例和數(shù)量增加，而具有抗腫瘤細(xì)胞作用的CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量降低，增殖受阻和凋亡增加，提示腫瘤形成和發(fā)展過程中機(jī)體免疫功能的復(fù)雜變化，且主要表現(xiàn)為抑制腫瘤作用減弱，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展因素增強(qiáng)。因此，如何扭轉(zhuǎn)這一免疫功能變化，將會(huì)為臨床胃癌患者的治療提供新的方向，但具體免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中所起的作用仍需進(jìn)一步研究闡明。