基于網絡生物信息學篩選精神分裂癥關鍵基因

吳亞娟，趙 楠，錢科佳，惠 濤，潘繼英

（張家港市第四人民醫院精神科，江蘇 張家港 215600）

目前精神分裂癥（schizophrenia）病因尚不清楚，通過現象學方法無法辨別因果關系，而有關基因功能和遺傳變異的研究對闡明精神分裂癥的病因機制和了解環境因素對精神分裂癥的影響都具有重大意義[1]。近十年來精神分裂癥的全基因關聯研究改變了精神病學的研究領域，表明了在分子水平上精神分裂癥具有潛在的生物學基礎[2]。用人類多能干細胞和含有風險相關變體的基因組細胞建立精神分裂癥患者的神經元模型正在開展[3]。以基因為切入點，研究精神分裂癥風險相關的基因或可構建觀察和治療目標的系統模塊。然而，目前有文獻報道的精神分裂癥風險基因很多，彼此缺乏系統聯系。基于此，本研究采用生物信息學方法對精神分裂癥編碼基因進行分析，以期尋找更為精準的候選基因。

1 資料與方法

1.1 資料來源 于大鼠基因組數據庫（https://rgd.mcw.edu/wg/，RGD）中搜集人源精神分裂癥編碼基因。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂癥編碼基因的獲取 在RGD 數據庫檢索“schizophrenia”，在Results Matrix 中選擇human 下的gene 及protein-coding，即獲取人源精神分裂癥的編碼基因，檢索獲得391 條基因信息。

1.2.2 基因本體功能注釋（GO）使用在線基因注釋軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對精神分裂癥相關編碼的391 個基因進行GO 功能富集分析，以P＜0.05為篩選條件，從生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三方面對391 個基因最可能涉及到的功能進行篩選，將結果以txt 文本格式保存，后利用R 軟件作圖。

1.2.3 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集析 使用在線基因注釋軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對391 個基因進行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，篩選最可能涉及到的通路，將結果以txt 文本格式保存，后利用R 軟件作圖。

1.2.4 蛋白相互作用網絡分析 使用在線軟件（https://string-db.org/）對391 個基因構建蛋白質相互作用網絡圖，預測編碼蛋白間的相互作用，將391 個基因以基因列表的形式上傳網站，后點擊左欄multiple proteins 按鈕，將篩選條件設置為combined score 即相互作用分數大于0.7，導出結果以TSV 格式保存。

1.2.5 關鍵基因的篩選 將String 網站下載的結果TSV 文件導入到cytoscape 軟件（3.6 版本），利用插件Mcode 篩選關鍵模塊，以cytohubba 插件篩選熱點基因，為提高篩選的可靠性，取用cytohubba 中的degree、mcc、mnc3 種算法分別計算排名前10 位的熱點基因，然后取交集，結合這些候選基因是否處在關鍵模塊中，最終篩選出關鍵基因。

2 結果

2.1 GO 分析結果 BP 生物學過程功能富集分析結果顯示，GO:0033141～富集于STAT 蛋白磷酸化修飾的基因數量有10 個，GO:0002323～富集于免疫反應中自然殺傷細胞活化的基因數量有10 個，GO:0002286～富集于免疫反應中T 細胞活化的基因數量有10 個，見圖1。MF 分子功能富集分析結果顯示，GO:0005132～參與Ⅰ型干擾素受體結合的基因數量有10 個，GO:0005125～參與細胞因子活化的基因數量有12 個，GO:0005234～參與谷氨酸門控離子通道活化的基因數量有5 個，見圖2。CC 細胞組分功能富集分析結果顯示，GO:0030054～富集于細胞連接處的基因數量有23 個，GO:0045211～富集于突觸后膜上的基因數量有15 個，GO:0030424～富集于軸突的基因數量有14 個，見圖3。

圖1 生物學過程功能富集結果

圖2 分子功能富集結果

圖3 細胞組成富集結果

2.2 KEGG 通路富集分析結果 391 個基因主要富集通路包括：hsa04623：細胞質DNA 感覺通路，富集于其上的基因數量有12 個；hsa04622：RLR 信號通路，富集于其上的基因數量有10 個；hsa05320：自身免疫甲狀腺疾病，富集于其上的基因數量有9 個，見圖4。

圖4 KEGG 功能富集結果

2.3 蛋白互作網絡分析結果 364 個蛋白發生相互作用，平均節點分數0.852，刪除聯系較少的節點，其中156 蛋白之間聯系程度緊密，見圖5。

圖5 蛋白互作網絡圖

2.4 關鍵模塊及關鍵基因 關鍵模塊中包含11 個基因，分別為TAAR6、DRD2、DRD4、CHRNA7、ZNF804A、DTNBP1、POX2、NRG1、DAO、DISC1、ZDHHC8，其中ZDHHC8 為種子基因，見圖6。結合cytohubba 的三種算法，最終獲取6 個關鍵基因，分別為DTNBP1、DAO、DRD2、DISC1、NRG1、ZDHHC8。

圖6 關鍵基因模塊圖

3 討論

目前認為與精神分裂癥發生密切相關的各種因素中，遺傳因素是最具影響力的，得到較多生物學證據支持[4]。此外，在精神分裂癥的成因中有一些經典假說，包括多巴胺假說、谷氨酸生化假說、神經發育假說。對精神分裂癥生物標志物的研究也大都圍繞這些假說開展。本研究發現精神分裂癥的病理過程或有免疫因素參與，對精神分裂癥編碼基因的GO分析發現，大部分基因與免疫反應密切相關，包括以自然殺傷細胞為代表的先天免疫和以T 細胞為代表的適應性免疫。最近有研究指出，精神分裂癥的病因與免疫系統調節紊亂密切相關，免疫過程在中樞神經系統的穩態、恢復力和腦儲備中起著至關重要的作用[5]。除此以外，有研究指出利用免疫系統治療或可改善大腦健康，T 細胞分泌IL-4，而IL-4 能刺激星形膠質細胞因子釋放，促進小膠質細胞和炎性巨噬細胞的轉化，使神經炎性M1 表型向保護性神經元M2 模式轉換[6]。本研究還發現這些基因的分子功能大多涉及到細胞因子的活化。Moriss G 等[7]研究表明，活化的細胞因子作為炎癥反應的一部分，可以改變5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸等神經遞質的釋放和重攝取。近年來，免疫炎癥假說也持續受到關注，來自于臨床及臨床前研究等多項證據提示，精神分裂癥患者血清白細胞介素家族中多種因子、γ-干擾素（IFN-γ）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）等促炎性細胞因子水平發生改變[8]。此外，本研究對這些基因的通路富集結果還發現TOLL 樣受體（TLRs）信號通路似乎在精神分裂癥中扮演著重要作用。TLRs主要參與固有免疫的調節，研究發現在精神分裂癥早期階段即可出現TLR 表達異常，并且TLRs 可影響認知功能[9，10]。最近關于抑郁和TLR 的動物研究發現[11]，選擇性地阻斷TLR2/4 在小膠質細胞中的表達，會抑制小鼠的抑郁行為。這些研究說明TOLL 樣受體信號通路參與精神疾病的病理過程，但其究竟如何影響精神疾病的發展還需進一步研究驗證。

本研究進一步對391 個編碼基因進行蛋白互作分析，篩選精神分裂癥相關的關鍵基因，發現DTNBP1、DAO、DRD2、DISC1、NRG1、ZDHHC8 與 精神分裂癥具有較高的相關性，其中DRD2 和DISC1是目前公認的精神分裂癥的易感基因[12，13]。本研究發現NRG1 也和精神分裂癥密切相關，與文獻結果相一致，最近研究發現NRG1 基因表達水平與精神疾病患病風險有關[14]，李婷等[15]則發現首發精神分裂癥患者血清NRG1 與認知功能相關。本研究發現DAO 基因也是參與精神分裂癥發生發展的關鍵基因，有文獻報道DAO 基因編碼的D-氨基酸氧化酶在精神分裂癥的病理機制中發揮作用[16]，并且其基因型與精神分裂癥及神經認知缺陷相關[17]，而目前研究不足以突出DAO 對精神分裂癥的重要性，顯然后續需要對DAO 基因進行更深入的研究。目前對于本研究結果中的DPNBP1 基因和精神分裂癥關系文獻報道還比較少，但已有文獻支持DPNBP1 與精神分裂癥患者背外側前額葉皮層樹突形成有關，并且其基因多態性與持續注意和固定轉移有關[18，19]。另外本研究發現關鍵模塊中的ZDHHC8 是種子基因，與其他的編碼蛋白都能產生相互作用。然而，現有對ZDHHC8 的研究只能證實它與精神分裂癥患者皮質體積有關[20]，針對巴西人的研究發現它與精神分裂癥易感基因有關[21]。早年有報道ZDHHC8 單核苷酸多態性rs175174 與22q11 缺失綜合征或精神分裂癥的精神病學特征無關[22]，這或許導致后來研究未再對ZDHHC8 引起重視。結合本研究結果，推測ZDHHC8 可能是通過與精神分裂癥其他易感基因發生作用，但對此推論需要后續更多的證據支持。

綜上所述，免疫炎癥反應和精神分裂癥的病理機制密切相關，其中TOLL 樣受體信號通路和NRG1 信號通路值得關注，而關鍵基因DTNBP1 和ZDHHC8 與精神分裂癥的直接關系還有待進一步研究。