雷帕霉素經自噬/Nrf2途徑調節腫瘤相關巨噬細胞功能在膀胱癌進展中的作用①

曹振學 馬坦途 孫巍 劉貝貝 劉建民 郭園園（蚌埠醫學院第一附屬醫院泌尿外科，蚌埠233004）

膀胱癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤，難以抑制的高復發率和轉移率是膀胱癌的重要特征。然而，針對膀胱癌復發和轉移的治療方式改進緩慢，以鉑類為基礎的系統化療仍為晚期和轉移性膀胱癌的主要治療手段。近期研究顯示膀胱癌的發生和基因高突變率密切相關，其中超過40%的基因突變集中于mTOR信號通路，這表明mTOR通路可能在膀胱癌的發生發展中扮演重要角色［1-2］。盡管臨床前研究通過體內外實驗證實mTOR抑制劑對膀胱癌細胞具有顯著抑制作用，但轉化性臨床研究顯示膀胱癌患者并未從靶向mTOR的藥物治療中得到額外的生存獲益［3-6］。

腫瘤微環境可能是基礎到臨床研究轉化失敗的影響因素之一，巨噬細胞是腫瘤微環境中重要的免疫細胞，在炎癥與腫瘤發生調節過程中起關鍵性作用。近期研究發現mTOR抑制劑雷帕霉素誘導腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）自噬能夠影響腫瘤細胞的發生、侵襲和轉移，但TAMs自噬對其功能的影響以及在膀胱癌進展中的作用尚不清楚。本研究在觀察雷帕霉素誘導TAMs自噬對膀胱癌細胞影響的基礎上，進一步考察了TAMs自噬對細胞功能的作用及其機制，為mTOR抑制劑雷帕霉素治療膀胱癌的基礎和臨床轉化提供了依據，具有重要的理論意義和臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料THP-1細胞系購自中國科學院上海細胞研究所；雷帕霉素、3-MA、PMA（佛波酯）、LC3購自美國Sigma公司；人重組IL-4購自美國R&D公司；CD206抗體購自艾博抗（Abcam）公司；CD206-APC流式抗體購自美國BD公司；PCR引物由生工公司合成；SYBR Green Real-time PCR Master Mix，Rever-Tra Ace qPCR RT試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；HRP標記的二抗、熒光二抗購自碧云天公司。激光共聚焦顯微鏡（D-Eclipse-C1）購于日本Nikon；PCR系統（GeneAmp970）購自美國PE公司；流式細胞儀（BD FACSCelesta）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 TAMs極化及鑒定THP-1人單核細胞系常規培養于37℃、5%CO2條件的細胞培養箱中，培養液為含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養液。選擇對數生長期的THP-1細胞，在其細胞匯合率達80%左右時，重置細胞密度為1×106～4×106個/cm2，按10 ng/ml的濃度加入PMA作用細胞72 h，刺激THP-1細胞單核細胞分化為巨噬細胞，然后繼續以IL-4 20 ng/ml的濃度刺激細胞極化為TAMs。然后通過以下方式鑒定極化成功：①流式細胞術檢測TAMs表面分子CD206；②qRT-PCR檢測arg-1、il-10、vegf和mgl-1等TAMs相關細胞因子表達。

1.2.2 流式細胞學檢測巨噬細胞CD206表達極化成功的TAMs細胞，經胰酶消化，離心棄上清，PBS漂洗細胞2次后重懸細胞，按照1∶100加入CD206-APC抗體，4℃孵育1 h，離心棄上清，PBS漂洗后重懸細胞，流式細胞儀檢測分析。

1.2.3 免疫熒光檢測細胞或組織CD206和LC3表達組織切片需經脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復、PBS漂洗、3%H2O2阻斷內源性過氧化氫酶等步驟；細胞需行細胞爬片、多聚甲醛固定步驟。然后組織切片和細胞爬片用血清室溫封閉30 min，1∶100加入CD206或（和）LC3抗體，4℃孵育過夜。漂洗后滴加熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗后滴加DAPI避光孵育10 min，隨后PBS漂洗、封片，應用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測TAMs相關分子的表達根據Trizol說明書提取細胞總RNA，cDNA逆轉錄根據TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書進行。qPCR反應采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix，使 用ABI 7500系統上機檢測，具體檢測步驟及反應條件設置按照試劑盒說明書進行，所有樣品做3個復孔，RNA相對表達量以2-ΔΔCt方法計算。引物見表1。

表1 TAMs相關細胞因子引物序列Tab.1 Primer sequences for TAMs related lytokines

1.2.5 ELISA檢測TAMs相關分子取雷帕霉素處理的TAMs細胞，離心并收集細胞上清液。取標準品和未稀釋的上清液各100 μl，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進行檢測細胞上清液中TGF-β、VEGF、IL-10、Arg-1的蛋白表達。

1.2.6 組織標本收集收集我科臨床病例診斷明確的肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）患者，術中留取膀胱癌及對應的癌旁組織（PC）樣本各20例，留取組織后立即多聚甲醛固定，制作石蠟標本，用于免疫組化和免疫熒光檢測。該方案經蚌埠醫學院倫理委員會批準通過（倫科批字［2017］第008號），且患者簽署知情同意書。

1.2.7 電鏡檢測細胞自噬小體將藥物干預的TAMs制作細胞爬片，3%戊二醛固定后送電鏡室進一步處理和電鏡觀察。

1.2.8 TAMs與膀胱癌細胞共培養模型將TAMs以2×105個/ml密度接種于半透膜孔徑為0.4μm的6孔Transwell板下室中，待TAMs貼壁后，在上室中接種T24人膀胱癌細胞，構建非接觸共培養體系。

1.2.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將藥物預處理的TAMs鋪板后，與T24人膀胱癌細胞共培養。10μl槍頭在T24細胞培養皿中劃線，PBS輕輕沖洗去除劃下的細胞，在無血清培養基條件下繼續培養24 h，顯微鏡下觀察劃痕變化。

1.2.10 Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力將藥物預處理的TAMs鋪板后，與T24人膀胱癌細胞共培養24 h，然后將T24細胞的上室取出，直接放置于加有10% FBS和培養基500μl的下室中，放入37℃孵箱培養24 h，取出上室并吸去多余液體，PBS清洗2次，加入結晶紫染液染色5 min，清洗后鏡下觀察拍照。

1.3 統計學處理采用統計軟件SPSS22.0進行數據分析，所有數據均用±s表示，組間比較選用t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TAMs誘導和鑒定THP-1細胞經PMA刺激后，細胞由懸浮轉變為貼壁生長，同時形態由類圓形變為不規則并伸出偽足，表明THP-1分化成為巨噬細胞（M0）。進一步用IL-4刺激巨噬細胞向TAMs極化，IL-4刺激后細胞形態變化不明顯（圖1A）。流式細胞學檢測TAMs膜標記物CD206，結果顯示IL-4刺激后CD206陽性的巨噬細胞顯著增多（圖1B、C，P＜0.01）。此外，RT-PCR檢測發現TAMs細胞因子il-10、vegf和mgl-1等表達顯著增加（圖1D，P＜0.05，P＜0.01）。以上結果表明，THP-1細胞被成功誘導極化為TAMs。

圖1 TAMs的誘導和鑒定Fig.1 Induction and identification of TAMs

2.2 雷帕霉素誘導TAMs自噬增強膀胱癌細胞遷移和侵襲雷帕霉素處理TAMs后，電鏡觀察細胞自噬小體變化，發現雷帕霉素增加了TAMs的自噬小體數量（圖2A）。免疫熒光表明雷帕霉素處理后TAMs自噬標記物LC3表達增加，自噬抑制劑3-MA能夠抑制LC3的表達（圖2B）。以上結果證明，雷帕霉素能夠誘導TAMs自噬。將雷帕霉素干預的TAMs與膀胱癌細胞共培養，劃痕實驗和Transwell實驗檢測膀胱癌遷移和侵襲能力（圖3A、B），結果表明，雷帕霉素預處理的TAMs能夠明顯促進膀胱癌細胞的遷移和侵襲，同時可促進膀胱癌細胞N-cadherin、Snail和Slug等間質樣因子的表達（圖3C），說明雷帕霉素可能通過誘導TAMs自噬增強膀胱癌細胞遷移和侵襲能力。

圖2 雷帕霉素誘導TAMs自噬Fig.2 Rapamycin induces autophagy in TAMs

圖3 雷帕霉素干預的TAMs增強膀胱癌細胞遷移和侵襲能力Fig.3 Rapamycin treated TAMs increase migration and invasion of bladder cancer cells

2.3 雷帕霉素誘導自噬增強TAMs Nrf2及細胞因子表達應用Western blot和ELISA方法分別檢測雷帕霉素增強自噬的TAMs細胞因子的基因和蛋白表達。結果表明，雷帕霉素明顯增加了VEGF、IL-10和Mgl1等細胞因子的基因和蛋白表達，而3-MA能夠抑制雷帕霉素的作用（圖4A、B，P＜0.05，P＜0.01），表明雷帕霉素通過誘導自噬影響TAMs分泌功能。除此之外，通過免疫熒光發現雷帕霉素能夠促進轉錄因子Nrf2的表達和核內轉移，3-MA抑制自噬可部分逆轉雷帕霉素的作用（圖5A），且通過siRNA干擾TAMs Nrf2表達可部分抑制雷帕霉素對arg-1、vegf和il-10等細胞因子表達的增強作用（圖5B，P＜0.05，P＜0.01），以上結果說明雷帕霉素誘導自噬通過Nrf2增強TAMs的功能。

圖4 雷帕霉素促進TAMs相關細胞因子的表達Fig.4 Rapamycin increases expression of TAMs related cytokines

圖5 雷帕霉素誘導自噬增強TAMs Nrf2及細胞因子表達Fig.5 Rapamycin induced autophagy enhances Nrf2 and cytokines expressions of TAMs

2.4 膀胱癌及癌旁組織腫瘤相關腫瘤細胞和自噬的表達通過免疫熒光雙染技術檢測膀胱癌組織及癌旁組織中TAMs標記物CD206和自噬標記物LC3的表達，發現膀胱癌組織中CD206和LC3表達均明顯增加，且大部分CD206陽性細胞的LC3表達增加（圖6A）。此外，免疫組化結果顯示膀胱癌組織中N-cadherin和Vimentin侵襲相關分子的表達增加（圖6B）。以上結果表明TAMs自噬表達增加與膀胱癌的發生發展相關。

圖6 TAMs自噬在膀胱癌及癌旁組織中的表達Fig.6 Expressions of TAMs autophagy in bladder cancer and adjacent tissues

3 討論

腫瘤免疫微環境是調節腫瘤發生和進展的重要機制，作為免疫微環境中主要的間質細胞，巨噬細胞主要通過兩種極化表型（M1和M2型）在膀胱癌進展中發揮不同作用［7］。孫穎浩和許傳亮教授團隊［8］通過TCGA數據庫分析及臨床組織樣本免疫組化等方法，發現M2巨噬細胞為膀胱癌組織中浸潤的主要免疫細胞，進一步分析表明M2巨噬細胞浸潤程度與膀胱癌組織學類型、分期、組織學分級及患者預后密切相關。MARTINEZ等［9］通過細胞實驗及膀胱癌臨床樣本分析證實BMP4能夠刺激巨噬細胞向M2型極化，從而促進膀胱癌進展。本研究探討了mTOR抑制劑雷帕霉素對TAMs功能的影響及機制，以及對膀胱癌細胞的影響，探討臨床改善雷帕霉素對膀胱癌的療效提供思考方向。

自噬是細胞將胞質中受損的細胞器和積聚的蛋白降解并再利用的過程，是細胞維持自身穩態的機制之一。TONG等［10］研究發現在腫瘤缺氧環境中，饑餓誘導自噬增強，并通過TGF-β1/smad3途徑促進膀胱癌細胞EMT發生，并能夠激活HIF-1α從而增強膀胱癌細胞吉西他濱耐藥，而這些作用能夠被自噬抑制劑3-MA阻斷［11］。除此之外，氯喹能夠抑制自噬促進膀胱癌細胞凋亡及增強對放療的敏感性［12］。近期研究發現TAMs自噬能夠影響腫瘤細胞的發生、侵襲和轉移，但對于不同腫瘤細胞的作用并不一致。SHAO等［13］研究結果顯示增強TAMs自噬有效抑制了結直腸癌細胞的增殖，誘導其發生凋亡，并增強癌細胞對放療的敏感性。另一方面，YANG等［14］研究則表明Cathepsin S介導的巨噬細胞自噬能夠刺激其向M2巨噬細胞極化，并增強SL4結腸癌細胞的生長和轉移能力。然而，巨噬細胞自噬在膀胱癌遷移侵襲中的作用仍不清楚。本研究發現膀胱癌組織中巨噬細胞主要為M2型巨噬細胞，且其自噬增強。體外研究證實雷帕霉素增強TAMs自噬并促進膀胱癌細胞的遷移和侵襲，該結果為TAMs自噬對腫瘤細胞的作用增加了證據。

Nrf2是調控細胞對抗氧化應激的關鍵轉錄因子之一，近年發現Nrf2參與了腫瘤的發生發展，且該過程多與Nrf2對炎癥因子的調控相關。ERI H.KOBAYASHI等［15］通過ChIP-seq和ChIP-qPCR分析發現巨噬細胞Nrf2結合于促炎基因IL-6及IL-1β的鄰近區域，通過抑制RNA聚合酶Ⅱ的招募，從而阻斷炎癥因子的表達，證實Nrf2是細胞介質生成的調節因子并發揮抗炎作用。FENG等［16］發現肝癌（Hep G2和Huh 7）和胰腺癌（SUIT2和Panc-1）細胞能夠活化單核細胞Nrf2表達并促使向M2型巨噬細胞轉化，Nrf2除可下調IL-6及IL-1β表達外，還可增強巨噬細胞VEGF的表達和分泌，從而反饋性促進腫瘤的進展。最新研究證實通過雷帕霉素干預細胞自噬可通過活化Nrf2影響軟骨細胞的干細胞特性，抑制氧化應激損傷和老化［17］。在本研究中，進一步發現雷帕霉素可通過自噬促進Nrf2表達和入核，從而增強TAMs抗炎因子表達，促進膀胱癌細胞的侵襲能力。

綜上所述，TAMs在膀胱癌的發生發展中扮演了重要的角色。本研究發現TAMs能夠促進膀胱癌細胞的侵襲和轉移，雷帕霉素誘導自噬并進一步通過Nrf2途徑增強TAMs功能。該研究充實了膀胱癌腫瘤免疫微環境理論，為mTOR抑制劑雷帕霉素控制膀胱癌進展提供了理論依據。