肺外源性急性呼吸窘迫綜合征關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析①

湯娜娜 謝登海 楊國(guó)輝（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)科ICU，貴陽(yáng)550004）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是多種原因?qū)е碌募毙詮浡匝装Y性肺損傷，臨床表現(xiàn)為急性低氧血癥，進(jìn)行性呼吸窘迫，在呼氣末正壓通氣（positive end expiratory pressure，PEEP）≥5 cm H2O條件下，氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤300 mmHg，胸部影像學(xué)表現(xiàn)為不能完全用心衰解釋的累及雙肺滲出性病變［1］。自1967年首次提出該臨床綜合征已過50余年，盡管對(duì)ARDS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)在不斷深入，治療方法在不斷改進(jìn)，但ARDS患者住院死亡率仍高達(dá)40%以上，嚴(yán)重危害著人類健康［2］。根據(jù)致病因素不同，臨床上可將ARDS分為兩類：肺源性ARDS（ARDS induced by pulmonary causes，ARDSp）和 肺 外 源 性ARDS（ARDS induced by extra pulmonary causes，ARDSexp）。ARDSp常見于各種病因所致的肺炎、肺挫傷、胃內(nèi)容物的誤吸、煙霧吸入等。ARDSexp常見病因有膿毒癥、重癥創(chuàng)傷、急性胰腺炎和大量輸血等。肺外組織器官感染所致的膿毒癥是ARDSexp的臨床常見病因，但肺外膿毒癥并發(fā)ARDSexp的比例并不高，在西方國(guó)家發(fā)生率約6%～7%［3-5］。為何僅有部分膿毒癥患者并發(fā)ARDSexp，相關(guān)機(jī)制尚未明確，也尚無(wú)理想的有助于早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。患者一旦并發(fā)ARDS，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后極差，晚期干預(yù)措施非常有限。如何能早期識(shí)別這類高危患者，是救治成功的關(guān)鍵，也仍是目前醫(yī)務(wù)工作者們面臨的難題。通過高通量基因測(cè)序，對(duì)ARDS患者的基因表達(dá)和信號(hào)通路的研究，有助于ARDS發(fā)病機(jī)制的探討和揭示。本研究擬通過生物信息學(xué)方法，對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)膿毒癥誘發(fā)的ARDSexp的基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)基因、生物學(xué)過程、信號(hào)通路及關(guān)鍵基因等重要信息，為探討ARDSexp發(fā)生、發(fā)展中基因的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選后下載KANG ELARIS等［3］2015年提交的基因芯片數(shù)據(jù)GSE66890。該芯片的平臺(tái)信息：GPL6244［HuGene-1_0-st］Affymetrix Human Gene 1［transcript（gene）version］（Affymetrix Inc.Santa Clara，California，USA）。芯片共包含57例膿毒癥患者（其中29例并發(fā)ARDS）的全血mRNA標(biāo)本。血標(biāo)本在患者被收入ICU 24 h內(nèi)進(jìn)行采集，使用相同材料和方法分兩個(gè)批次進(jìn)行處理。本研究選取了其中的23例肺外膿毒癥患者的數(shù)據(jù)為研究對(duì)象，以并發(fā)ARDSexp的8例患者作為實(shí)驗(yàn)組（Sepsis+ARDSexp），剩余的15例未并發(fā)ARDS的患者作為對(duì)照組（Sepsis Only）進(jìn)行研究。

1.2 方法

1.2.1 兩組患者臨床特征比較比較兩組患者年齡、性別、檢測(cè)批次、血常規(guī)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)等臨床特征有無(wú)差異。采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)［median］表示，兩組比較采用U檢驗(yàn)；分類變量用百分比（%）表示。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2 差異表達(dá)基因的篩選GEO2R（https：//w ww.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是基于R編程語(yǔ)言的開源軟件，通過使用來(lái)自Bioconductor的GEOquery和limma程序包來(lái)分析高通量基因組數(shù)據(jù)，應(yīng)用t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEGs）。篩選條件為差異表達(dá)倍數(shù)（FC）≥1.5，即|log2FC|＞0.585且P＜0.05。

1.2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路分析利用DAVID在線分析平臺(tái)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO注釋包括分子功能（molecular function，MF），參與的生物學(xué)過程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）。對(duì)富集的功能及信號(hào)通路進(jìn)行可視化圖形展示。以P＜0.05作為生物信息分析的閾值。

1.2.4 差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵基因的篩選通過STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.string-db.org/）預(yù)測(cè)蛋白之間的相互關(guān)系。以綜合評(píng)分（combination score）＞0.4為閾值條件，將STRING中所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）圖，PPI圖是由多個(gè)節(jié)點(diǎn)和多條邊組成，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)，每條邊表示蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過Cytoscape中的插件Cytohubba［6］計(jì)算關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床特征比較年齡、性別和標(biāo)本處理批次差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組一般情況均衡可比。白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Sepsis+ARDSexp組所有病例均并發(fā)休克，顯著高于對(duì)照組（P=0.007，表1）。

表1 兩組臨床特征比較Tab.1 Clinical characteristics in two groups

2.2 差異表達(dá)基因的篩選Sepsis+ARDSexp組和對(duì)照組一共篩選出288個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因128個(gè)，下調(diào)基因160個(gè)。DEGs火山圖見圖1，紅點(diǎn)表示上調(diào)的DEGs，藍(lán)點(diǎn)表示下調(diào)的DEGs。表2和表3分別列出了Sepsis+ARDSexp組與對(duì)照組比較，差異表達(dá)顯著上調(diào)和下調(diào)前10位的基因。

表2 上調(diào)的差異表達(dá)基因（前10位）Tab.2 Up-regulated DEGs（TOP 10）

表3 下調(diào)的差異表達(dá)基因（前10位）Tab.3 Down-regulated DEGs（Top 10）

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano map of DEGs

2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG通路富集分析利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要富集炎癥反應(yīng)、細(xì)胞防御、平滑肌細(xì)胞增殖、IL-1分泌和細(xì)胞免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程（圖2A）。細(xì)胞組成主要富集于外泌體、細(xì)胞膜和細(xì)胞漿等（圖2B）。分子功能主要富集碳水化合物結(jié)合、蛋白同源二聚體活化、受體激活和蛋白結(jié)合等功能（圖2C）。而KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs主要富集于吞噬體、cGMP-PKG信號(hào)通路、造血、味覺傳導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工等相關(guān)信號(hào)通路（圖2D）。

圖2 差異表達(dá)基因GO和KEGG通路富集分析Fig.2 GO and KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

2.4 差異表達(dá)基因的蛋白互做分析及關(guān)鍵基因篩選將288個(gè)DEGs導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)，以綜合評(píng)分＞0.4為有效篩選標(biāo)準(zhǔn)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建由161個(gè)節(jié)點(diǎn)和296條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。通過Cytohubba插件中的MCC計(jì)算法篩選出前8位關(guān)鍵基因：CCR2、CXCR2、TAS2R20、TAS2R39、TAS2R40、S1PR1、HCAR2和HCAR3（表4）。

表4 關(guān)鍵基因篩選結(jié)果Tab.4 Result of hub genes screening

圖3 PPI圖Fig.3 Protein-protein interaction network

3 討論

近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展和各種高通量技術(shù)的興起，大量基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)及全基因組測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用，通過生物信息學(xué)分析技術(shù)，可以找出疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因，有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，為尋找疾病新的治療方法和預(yù)后的監(jiān)測(cè)提供新的方向［7］。本文通過在GEO下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE66890，將膿毒癥并發(fā)的ARDSexp患者全血標(biāo)本和肺外膿毒癥對(duì)照患者全血標(biāo)本的芯片數(shù)據(jù)對(duì)比，共篩選出288個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因128個(gè)，下調(diào)基因160個(gè)。GO分析顯示，DEGs主要富集炎癥反應(yīng)、細(xì)胞防御和免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程。KEGG分析顯示主要富集于吞噬體、cGMP-PKG信號(hào)通路、造血、味覺傳導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)信號(hào)通路。通過蛋白互做分析，篩選出8個(gè)關(guān)鍵基因，其中S1PR1表達(dá)水平上調(diào)，其余7種基因水平下調(diào)。

趨化因子是能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子細(xì)胞因子。根據(jù)其N端半胱氨酸的位置分為四大類：CC、CXC、C和CX3C，相應(yīng)的受體分別為CCR、CXCR、CR和CX3CR。趨化因子與其受體相互作用能誘導(dǎo)靶細(xì)胞趨化性遷移，增強(qiáng)靶細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力等，廣泛參與多種生理病理過程。CCR2、CXCR2與配體結(jié)合后，在感染部位募集中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)和顆粒釋放，減輕炎癥反應(yīng)，增加細(xì)菌清除，從而在炎癥介導(dǎo)過程的發(fā)揮重要作用。CXCR2的異常調(diào)控已涉及腫瘤和多種炎癥介導(dǎo)疾病［8-9］。肺部的炎癥反應(yīng)是ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要原因，中性粒細(xì)胞大量聚集在肺微血管、間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)是ARDS的重要特征，趨化因子在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺部中發(fā)揮主要作用。通過對(duì)臨床ARDS患者的樣本和ARDS動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)肺中性粒細(xì)胞遷移的趨化因子網(wǎng)絡(luò)可能涉及多個(gè)趨化因子配體及受體家族［10-11］。有研究報(bào)道分析ARDS患者血液和肺泡灌洗液分離的中性粒細(xì)胞CXCR2的表達(dá)無(wú)顯著性差異，但血液中的中性粒細(xì)胞CCR2的表達(dá)水平明顯低于肺泡灌洗液［12］。本文分析發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，ARDSexp患者全血中CCR2和CXCR表達(dá)均下降，但還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

苦味受體（bitter taste receptor，TAS2R）是與人體感受苦味物質(zhì)密切相關(guān)的一類G蛋白偶聯(lián)受體，TAS2R不僅存在于舌的味蕾中，在其他組織也表達(dá)并發(fā)揮功能。2010年DEEPAK等［13］首次發(fā)現(xiàn)，在人類氣道平滑肌上存在TAS2R。近年研究發(fā)現(xiàn)，TAS2R激動(dòng)劑可促進(jìn)氣道平滑肌松弛和支氣管擴(kuò)張，抑制絲裂原誘導(dǎo)的生長(zhǎng)［14］。TAS2R激動(dòng)劑如氯喹和苯甲地那銨可以抑制TNF-α，IL-13和MCP-1的釋放，氯喹還可以呈劑量依賴性抑制IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10等炎癥因子的產(chǎn)生，從而抑制氣道炎癥反應(yīng)，提示TAS2R激動(dòng)劑可作為一種新型有效的藥物用于支氣管哮喘、COPD等慢性炎癥性疾病治療［15-16］。2020年全球新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情暴發(fā)，我國(guó)學(xué)者通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)TAS2R激動(dòng)劑可通過TAS2R增強(qiáng)機(jī)體防御能力，抑制過度免疫炎癥反應(yīng)，可能對(duì)治療COVID-19有效［17］。TAS2R是否也在ARDS等呼吸道急性炎癥性疾病中發(fā)揮作用尚未見研究報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)TAS2R在ARDSexp患者全血中差異表達(dá)并可能作為關(guān)鍵基因影響ARDSexp的發(fā)生發(fā)展。

磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種具有生物活性的鞘氨醇代謝產(chǎn)物，通過與細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR）作用而發(fā)揮其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。S1PR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，目前S1PR已成為炎癥、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的研究熱點(diǎn)之一。有研究報(bào)道，S1PR激動(dòng)劑可抑制樹突狀細(xì)胞的活化和T細(xì)胞的增殖，顯著降低細(xì)胞因子/趨化因子的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴，可抑制甲型H1N1流感病毒誘發(fā)的急性肺損傷［18］。S1P-S1PR信號(hào)通路通過抑制炎癥反應(yīng)、維持血管屏障功能有望成為ARDS新的治療方法［19-20］。

羥基羧酸（hydroxy-carboxylic acids，HCA）包括乳酸、酮體3-羥基丁酸以及β-氧化中間體3-羥基辛酸。HCA既是能量代謝的中間產(chǎn)物也是一種信號(hào)分子，通過激活羥基羧酸受體（hydroxy-carboxylic acid HCA receptor，HCAR）參與機(jī)體代謝、免疫等功能調(diào)節(jié)［21］。HCAR也是G蛋白偶聯(lián)受體，其家族由3個(gè)成員組成，分別為HCAR1、HCAR2和HCAR3。HCAR2和HCAR3在人體內(nèi)表達(dá)廣泛，近期研究發(fā)現(xiàn)HCAR2激動(dòng)劑富馬酸單乙酯前體DMF，可降低中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附性和趨化性，對(duì)治療銀屑病、多發(fā)性硬化癥有積極作用［22］。HCAR在ARDS發(fā)病中是否也具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等功能，目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)HCAR2和HCAR3在ARDSexp患者全血中表達(dá)下調(diào)且均為關(guān)鍵基因。

綜上所述，本文通過對(duì)GEO中ARDSexp相關(guān)的基因芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出206個(gè)差異表達(dá)基因和并從中獲得8個(gè)關(guān)鍵基因。其中TAS2R20、TAS2R39、TAS2R40、HCAR2和HCAR3關(guān)鍵基因是首次發(fā)現(xiàn)在ARDSexp患者全血中差異表達(dá)。通過文獻(xiàn)挖掘，推測(cè)這些關(guān)鍵基因可能通過影響全身和肺局部炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及血管屏障等功能在ARDSexp的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可為ARDSexp的早期臨床診斷和個(gè)體化治療提供潛在靶點(diǎn)。由于本研究是基于數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，存在病例少，相關(guān)臨床資料提供不全等缺陷，故上述關(guān)鍵基因在ARDSexp患者中的表達(dá)和具體作用還需要后續(xù)的臨床和基礎(chǔ)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。