氨基胍對肺纖維化大鼠MMP-13、TIMP-1及轉化生長因子-β1/Smads信號通路的影響①

穆亞敏 黃希 宋志勇（湘潭醫衛職業技術學院，湘潭410004）

肺臟纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是累及肺間質、肺泡及肺血管的進行性疾病。臨床上PF常伴有限制性通氣功能受損，導致患者氣體交換障礙，呼吸困難，誘發低氧血癥，甚至導致患者出現呼吸衰竭，危及生命。PF病理機制尚未闡明，尚無根治手段。研究證實，肺部細胞外基質（extracellular matrix，ECM）驟然大量降解，過度積累，導致間質纖維化［1］。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及其天然抑制劑組織基質金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs）表達失衡是ECM合成與降解失衡的主要原因［2］。WU等［3］研究表明，調節大鼠肺組織TIMP-1表達有助于改善PF癥狀。轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是器官纖維化病變中公認的關鍵調控因子。信號轉導分子（sma and mad homologues，Smads）是TGF-β1與相應細胞表面的絲/蘇氨酸激酶受體結合后，負責將胞膜信號傳遞至胞核下游重要的介導分子。LEBRUN等［4］研究表明，TGF-β1信號分子被激活是PF的標志性事件。氨基胍是一種具有親核性能的肼類小分子，可抑制體內蛋白糖基化修飾，是臨床上針對糖基化終末產物確切的抑制劑。YOON等［5］研究證實，氨基胍在糖尿病腎病小鼠模型明顯抑制腎小球及腎間質纖維化。但氨基胍對PF作用的報道較少。本研究通過建立大鼠PF模型，觀察大鼠肺組織中MMP-13及TIMP-1表達，基于TGF-β1/Smads信號通路探討氨基胍對PF大鼠肺組織的保護作用，為氨基胍臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級8～10周齡SD雄性大鼠120只，體重200～220 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，依照我院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料喂養，自由飲水，分籠（4籠）適應性飼養1周后用于后續實驗。本研究經我院實驗動物管理倫理委員會批準（2019-032）。

1.1.2 主要試劑氨基胍（20 mg，美國Sigma公司，生產批號：L39964）；博萊霉素（15 mg/只，日本化藥株式會社，生產批號：H20090885）；地塞米松（0.75 mg，廣東華南藥業）；p-Smad2、p-Smad7、MMP-13、TIMP-1抗體、兔抗GAPDH抗體（美國Santa公司）；Western blot試劑盒（德國Rebstock公司）；免疫組化試劑盒、Masson染色試劑盒（南京建成生物有限公司）；HE試劑盒（上海碧云天公司）；蛋白濃度測定試劑盒、化學發光試劑盒（美國Forma公司）。

1.1.3 主要儀器LIOOS600T生物顯微鏡（日本尼康公司）；Bio-Rad凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；-80℃冰箱（德國維根斯公司）；Leica RM2135組織切片機（德國Leica公司）；高速低溫離心機（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組處理適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、氨基胍干預組（實驗組）、陽性對照藥地塞米松干預組（對照組），每組30只。模型組、實驗組、對照組大鼠一次性氣管滴注4 mg/ml博萊霉素氯化鈉（0.9%）溶液構建PF模型（1.25 ml/kg）［6］，正常組大鼠滴注等劑量等濃度氯化鈉溶液。滴注完畢后實驗組、對照組大鼠每日分別腹腔注射1 ml氨基胍溶液（20 mg/kg）和1 ml地塞米松溶液（20 mg/kg），正常組、模型組分別腹腔注射等劑量生理鹽水。注射完畢后，所有大鼠正常飲食，自由飲水。藥物干預28 d后心臟穿刺處死大鼠，打開胸腔無菌取出肺組織，-80℃保存待測。

1.2.2 各組大鼠支氣管灌洗液（BALF）標本采集藥物干預28 d后，麻醉大鼠，心臟穿刺處死大鼠，分離完整氣管，并在左主支氣管進行氣管插管，絲線結扎，PBS沖洗3次，收集各組大鼠BALF，離心，取上清，-80℃保存待測。細胞沉淀經PBS緩沖液重懸，均勻鋪于載玻片，Wright Giemsa染色，顯微鏡下觀察總細胞和嗜中性粒細胞數。

1.2.3 肺組織濕重/干重（W/D）比例測定取各組10%大鼠肺組織，肉眼觀察各組大鼠肺組織解剖病理變化，無菌清洗，無菌吸水紗布吸干。稱重（濕重W），60℃烘箱中放置48 h，稱重（干重D），計算W/D。

1.2.4 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理學改變取各組10%肺組織標本，多聚甲醛固定24 h，包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察各組肺組織病理變化。

1.2.5 Masson染色觀察各組大鼠肺組織纖維化改變取各組大鼠10%肺組織，生理鹽水沖洗10 min，中性甲醛溶液固定，石蠟切片，常規脫蠟，無菌水清洗10 min，Masson復合液染色15 min，0.2%醋酸溶液清洗，5%磷鎢酸漂洗10 min，0.2%醋酸溶液清洗3次，2%苯胺藍復染5 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠固定，倒置熒光顯微鏡下觀察肺組織標本形態學變化。Masson染色后，肺肌細胞、紅細胞被染成紅色，而分布在細胞間隙的膠原纖維被染成藍色，胞核呈藍褐色［7］。

1.2.6 qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA表達取各組大鼠10%肺組織，常規提取肺組織細胞總RNA，測定RNA濃度，同時進行RNA完整性測定［8］。采用多基因梯度進行qRT-PCR反應，設計目標蛋白mRNA引物序列，反應過程以及條件：75℃預變性120 s；90℃變性5 min；60℃退火60 s；72℃延伸30 s；40個循環。以U6為內參，U6 F：5′-GATCTGCTATCCCACGGA-3′，R：5′-CTGACCAGCCATAGCCAGA-3′，TGF-β1 mRNA F：5′-GGAGCACTGAACGCACAGA-3′，R：5′-CTACGGAGATTCAAACTCGTG-3′，Smad2 mRNA F：5′-ATGCCGAGGAACAGATATCTA-3′，R：5′-CGACCATATCGCACGAGTGCA-3′，Smad7 mRNA F：5′-ATATCGGCCTATACTCGAT-3′，R：5′-CAGGATGCTAGTCGTAATGTA-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達。

1.2.7 免疫組化檢測各組大鼠肺組織MMP-13和TIMP-1表達取各組大鼠10%肺組織，10%甲醛固定，包埋，切片，脫蠟，PBS緩沖液修復2 h，室溫下3%過氧化氫浸泡，封閉，分別加一抗（1：1 000）4℃孵育過夜，次日PBS洗滌，分別加二抗（1：1 000），室溫孵育30 min，PBS洗滌。加適量DAB孵育5 min，去離子水終止反應，蘇木素復染5 min，無菌水沖洗，梯度乙醇脫水2 h，無菌濾紙吸凈表面殘存液體，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照，隨機取3個區域，計數視野中總細胞數以及陽性染色細胞數。目標蛋白表達率（%）=陽性染色細胞數/視野中總細胞數×100%。

1.2.8 Western blot檢測各組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表達取各組大鼠10%肺組織，常規裂解，冰浴5 min，離心，取上清，BCA測定蛋白濃度，凝膠電泳分離蛋白，轉至PVDF膜，5%TBST液室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1：1 000）4℃孵育過夜。次日沖洗干凈，加入二抗（1：10 000）室溫孵育，DAB顯色，以GAPDH為內參，E-Gel Imager凝膠成像儀檢測，計算目的蛋白相對表達。

1.3 統計學分析采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，采用Graphpad5.01軟件作圖，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠、BALF中嗜中性粒細胞、總細胞數以及肺組織W/D比較與正常組相比，模型組大鼠BALF中嗜中性粒細胞和總細胞數及肺組織W/D明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，實驗組、對照組大鼠BALF中嗜中性粒細胞和總細胞數以及肺組織W/D明顯降低（P＜0.05），實驗組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠BALF中嗜中性粒細胞和總細胞數及肺組織W/DFig.1 Number of neutrophils and total cell number in BALF and W/D of lung tissues of rats in each group

2.2 各組大鼠肺組織解剖學、組織病理學及纖維化比較各組大鼠肺組織解剖學改變結果顯示，正常組大鼠肺組織顏色呈粉紅色，表面光滑，質地柔軟、飽滿富有彈性，肺組織表面無出血點，無斑點，被膜無緊張，切面無滲出；模型組大鼠肺組織表面皺縮嚴重，取出肺組織時有泡沫樣黏液流出，肺組織明顯腫大，肺組織呈灰白色，表面有片狀淤血，出血點較多，觸摸時有明顯結節，同時被膜明顯僵硬，切面有滲出；實驗組、對照組大鼠肺組織較模型組有明顯好轉，出血點和淤血區域明顯減少。HE染色結果顯示，正常組大鼠肺組織結構完整，無充血、擴張及出血現象，肺泡腔結構清晰，肺泡壁厚度均勻，無增寬、滲出等，肺泡間隔及各級支氣管管腔內無水腫、無分泌物滲出、無炎癥細胞浸潤等。與正常組相比，模型組大鼠肺泡出現彌漫性病理實變，肺泡壁厚度不均一，明顯變小，間隔明顯增寬，腔內大量炎癥細胞填充，肺間質中出現大量成纖維細胞。實驗組、對照組大鼠肺組織病理癥狀有所緩解，肺泡大小均一，腔內少量水腫液填充，炎癥細胞明顯減少，間質內成纖維細胞數有所減少。Masson染色結果顯示，正常組大鼠肺組織結構清晰，視野內未見藍綠色膠原纖維沉積出現。與正常組相比，模型組大鼠肺組織間質中可見成片藍綠色膠原纖維沉積，分布均勻。實驗組、對照組大鼠肺組織間質中藍綠色膠原纖維沉積分布區域明顯減少（圖2）。

圖2 肺組織病理變化Fig.2 Pathological changes of lung tissue

2.3 免疫組化檢測各組大鼠肺組織MMP-13和TIMP-1表達免疫組化結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織TIMP-1表達明顯升高，MMP-13表達明顯降低（P＜0.05），與模型組相比，藥物干預后，實驗組、對照組大鼠肺組織TIMP-1表達明顯降低，MMP-13表達明顯升高（P＜0.05）。實驗組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 免疫組化檢測TIMP-1、MMP-13表達（×400）Fig.3 Immunohistochemistry detection of expressions of TIMP-1 and MMP-13（×400）

2.4 qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7 mRNA表 達RT-PCR檢 測 結 果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2 mRNA表達明顯升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），與模型組相比，藥物干預后，實驗組、對照組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），Smad7 mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；實驗組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 qRT-PCR檢測TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA表達Fig.4 TGF-β1，Smad2 and Smad7 mRNA expressions detected by qRT-PCR

2.5 Western blot檢測各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表達Western blot結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad2表達明顯升高，p-Smad7表達明顯降低（P＜0.05），與模型組相比，實驗組和對照組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad2表達明顯降低，p-Smad7表達明顯升高（P＜0.05）；實驗組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表達Fig.5 Expressions of TGF-β1，p-Smad2 and p-Smad7 in lung tissues of rats in each group

3 討論

PF是一種彌漫性致死率極高的肺間質疾病，其基本病理實質為多種因素（腫瘤、持續性輻射、放療與化療等）誘發的肺部損傷導致肺部細胞ECM過度積累，肺組織結構被破壞，影響患者肺功能，尚無快速有效的治療手段［9］。因此闡明PF的分子機制，及時降解ECM，對臨床治療PF具有重大意義。

氨基胍分子式為CH6N4，是一種肼類小分子，具有1個親核羰基基團，可導致多種氧化還原酶失活，在糖尿病腎病及心臟移植中廣泛應用。近年研究發現，氨基胍對器官纖維化病變中具有良好的抑制作用。MAGDALENO等［10］研究發現，糖尿病小鼠模型中氨基胍可通過抑制ERK/Smad通路傳導抑制膠原纖維合成，保護心臟免受纖維化損傷。YAO等［11］研究表明，氨基胍預處理可明顯減輕自發性高血壓大鼠心肌纖維化。AHMAD等［12］研究證實，氨基胍可抑制阿米卡星誘導的氧化應激作用。LV等［13］研究證實，氨基胍可降低腎小球細胞中MMP-9表達，抑制腎間質纖維化歷程，保護糖尿病腎病大鼠腎臟。本研究通過氣管滴注博萊霉素構建大鼠PF模型，結果表明，與模型組相比，實驗組大鼠肺組織W/D明顯降低，解剖學和PF組織病理明顯改善，膠原沉積區域明顯減小，肺組織中MMPs/TIMPs表達趨于平衡，表明氨基胍對PF治療效果良好。

TGF-β1/Smads是國際公認的致器官纖維化關鍵信號通路。TGF-β1被認為是最重要的肺臟致纖維化作用因子之一［14］。研究表明，TGF-β1高表達是PF形成的中心環節，尤其是在肺成纖維細胞中［15］。張丹等［16］研究證實，TGF-β1可明顯促進新生大鼠成纖維細胞體外增殖，促進其纖維化轉換。Smads蛋白在肺間質纖維化細胞外基質形成中發揮重要作用。Smad2是TGF-β1的受體蛋白，可將信號轉移至核內啟動膠原基因表達；Smad7是絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，STK）的拮抗蛋白，阻止激活型Smad2磷酸化。LI等［17］研究證實，抑制Smad2磷酸化可明顯減輕由二氧化硅誘導的肺纖維化。LUO等［18］研究證實，抑制TGF-β1表達，抑制Smad2磷酸化，增強Smad7磷酸化水平可明顯抑制博來霉素誘導的大鼠PF歷程。ZHANG等［19］研究報道，抑制TGF-β1/Smad2通路可有效保護博來霉素誘導的大鼠PF。NAMGUNG等［20］研究證實，氨基胍可明顯抑制TGF-β1/Smad通路，抑制纖維化，保護糖尿病腎病大鼠腎臟組織。本研究發現，與模型組相比，實驗組大鼠肺組織中TGF-β1和p-Smad2 mRNA和蛋白表達明顯降低，p-Smad7 mRNA和蛋白表達明顯升高。因此推測氨基胍對博來霉素誘導的大鼠PF的保護作用可能與調控TGF-β1/Smads信號通路表達有關。

綜上所述，氨基胍可保護博來霉素誘導的PF大鼠肺組織，可能通過調控TGF-β1/Smads信號通路，抑制TGF-β1和p-Smad2表達，增強p-Smad7表達發揮抗纖維化作用。但氨基胍是否通過其他通路影響PF進程有待進一步研究。