馬錢子堿對IL-6誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

張韻函 何珊珊 謝盛言 魏蓬萊

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院）婦產(chǎn)科，遵義563000）

宮頸癌是全球第三大常見女性癌癥，是發(fā)展中國家女性癌癥死亡的主要原因［1］。化療是宮頸癌輔助治療的重要手段，但由于化療耐藥、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致宮頸癌患者預(yù)后較差，5年生存率低于30%［2］。馬錢子為馬錢科植物馬錢子的干燥成熟種子，性味苦寒，具有通絡(luò)散結(jié)、消腫止痛之效。馬錢子堿為馬錢子主要生物堿類活性成分，具有止痛、抗炎、增強(qiáng)免疫和抗腫瘤作用［3-4］。研究顯示，馬錢子堿對宮頸癌細(xì)胞有顯著增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用［5］，但其抗宮頸癌作用的潛在機(jī)制尚未闡明。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一種約含有20個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因3'-非翻譯區(qū)（untranslated re-gion，UTR）結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在包括宮頸癌在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用［6］。研究顯示，宮頸癌患者血清中miR-34a-5p表達(dá)降低與病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)［7］。但miR-34a-5p在宮頸癌中的生物學(xué)作用、馬錢子堿是否通過調(diào)控miR-34a-5p表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用尚未闡明。IL-6在宮頸癌中表達(dá)增加，IL-6高表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移具有顯著促進(jìn)作用［8］。本研究通過檢測馬錢子堿對IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移侵襲及miR-34a-5p表達(dá)的影響，探討其可能機(jī)制，以期為馬錢子堿用于宮頸癌臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；DMEM培養(yǎng)基、北美胎牛血清、青鏈霉素雙抗、Trizol、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman Universal Master MixⅡ購于美國Invitrogen公司；馬錢子堿購于中國藥品生物制品檢定所；miR-34a-5p模擬物（miR-34a-5p mimics）及其陰性對照（miR-NC）、miR-34a-5p抑制物（anti-miR-34a-5p）及其陰性對照（anti-miR-NC）、細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8）購于上海生工公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購于美國康寧公司；兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體、兔源MMP9抗體、兔源β連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體、兔源β-actin抗體和羊抗兔IgG購于上海賽信通生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度中培養(yǎng)，細(xì)胞80%融合時1∶3傳代，3次/周。取2×105個對數(shù)期HeLa細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為60%時，更換為含血清培養(yǎng)基。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-NC、miR-34a-5p mimic、antimiR-NC、anti-miR-34a-5p分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h更換為含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組和處理HeLa細(xì)胞以2×104個/孔接種于24孔板，未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞分為正常對照（NC）組、IL-6組、馬錢子堿低、中、高劑量組。NC組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-6組采用IL-6終濃度為25 ng/ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)［9］；馬錢子堿低、中、高劑量組分別采用含50、100、200 mg/L馬錢子堿和25 ng/ml IL-6的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)［5］。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-34a-5p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-34a-5p的HeLa細(xì)胞用IL-6終濃度為25 ng/ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次命名為miR-NC+IL-6組、miR-34a-5p+IL-6組、anti-miR-NC+IL-6組、anti-miR-34a-5p+IL-6組。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-34a-5p的HeLa細(xì)胞采用含50、100、200 mg/L馬錢子堿和25 ng/ml IL-6的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次命名為高劑量+anti-miR-NC組、高劑量+anti-miR-34a-5p組。培養(yǎng)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力 各組取100 μl，5×103個細(xì)胞接種至96孔板，貼壁后10 μl/孔加入CCK-8試劑，孵育1.5 h，取出各組96孔板，空白孔歸零，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔吸光度。

1.2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲 采用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基將各組細(xì)胞稀釋為1×105個/ml的單細(xì)胞懸液，將Transwell小室置于24孔板，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，取500 μl含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入24孔板下室，孵育24 h，取出小室。無菌濕棉簽擦去Transwell小室膜上表面未過膜細(xì)胞，甲醇固定下表面，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇3個視野計數(shù)，以其均值表示細(xì)胞遷移情況。侵襲時采用預(yù)先包被基質(zhì)膠的Transwell小室，預(yù)先加入細(xì)胞培養(yǎng)基水化后使用，其他步驟與遷移實驗相同。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-34a-5p表達(dá)Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測定其濃度。采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman Universal Master MixⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)，2-ΔΔCt法計算miR-34a-5p相對表達(dá)。引物序列：miR-34a-5p F：5'-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3'，R：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.6 Western blot檢測MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表達(dá)RIPA裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA定量。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min變性，冷卻至室溫備用。30 μg/孔上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝聚底部，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶置于搖床4℃封閉過夜，加入稀釋的一抗溶液室溫孵育1 h，洗膜緩沖液洗膜10 min，重復(fù)3次，加入稀釋的一抗溶液室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，重復(fù)3次，加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影、曝光，Image J軟件進(jìn)行灰度分析，目的蛋白相對表達(dá)=目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每組設(shè)3個平行實驗，獨立重復(fù)3次，符合正態(tài)性的數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活力的影響 與NC組相比，IL-6組HeLa細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）；與IL-6組相比，馬錢子堿低、中、高劑量組HeLa細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05，表1）。

表1 不同濃度馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活力的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of different concentrations of brucine on viability of IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

表1 不同濃度馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活力的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of different concentrations of brucine on viability of IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P＜0.05；compared with IL-6，2）P＜0.05.

Groups NC IL-6 Brucine low-dose Brucine middle-dose Brucine high-dose F P OD450 0.854±0.060 1.257±0.1101）1.026±0.0802）0.728±0.0602）0.543±0.0402）123.948 0.000

2.2 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與NC組相比，IL-6組HeLa細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)增多，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與IL-6組相比，馬錢子堿高劑量組HeLa細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)減少，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，表2、圖1）。

表2 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of brucine on migration and invasion of IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

表2 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of brucine on migration and invasion of IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P＜0.05；compared with IL-6，2）P＜0.05.

Groups NC IL-6 Brucine high-dose F P MMP2 0.80±0.06 1.10±0.111）0.45±0.052）157.005 0.000 MMP9 0.72±0.06 0.99±0.101）0.53±0.052）89.609 0.000 Cell migration number 147.11±10.12 176.05±12.351）94.53±8.242）142.843 0.000 Cell invasion number 124.13±10.24 154.36±13.271）79.38±6.592）118.451 0.000

圖1 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig.1 Effect of brucine on migration and invasion of IL-6-treated HeLa cells

2.3 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)的影響 與NC組相比，IL-6組HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與IL-6組相比，馬錢子堿高劑量組HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)顯著升高（P＜0.05，表3）。

表3 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of brucine on expression of miR-34a-5p in IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

表3 馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of brucine on expression of miR-34a-5p in IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P＜0.05；compared with IL-6，2）P＜0.05.

Groups NC IL-6 Brucine high-dose F P miR-34a-5p 1.00±0.12 0.46±0.051）1.25±0.102）163.639 0.000

2.4 miR-34a-5p對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響 與miR-NC+IL-6組相比，miR-34a-5p+IL-6組HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低，遷移和侵襲數(shù)顯著減少，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC+IL-6組相比，anti-miR-34a-5p+IL-6組HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高，遷移和侵襲數(shù)顯著增加，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖2、表4）。

表4 miR-34a-5p對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-34a-5p on activity，migration and invasion of IL-6-treated HeLa cell（±s，n=9）

表4 miR-34a-5p對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-34a-5p on activity，migration and invasion of IL-6-treated HeLa cell（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC+IL-6，1）P＜0.05；compared with anti-miR-NC+IL-6，2）P＜0.05.

Groups miR-NC+IL-6 miR-34a-5p+IL-6 anti-miR-NC+IL-6 anti-miR-34a-5p+IL-6 F P miR-34a-5p 1.00±0.10 3.24±0.221）1.03±0.08 0.42±0.042）838.712 0.000 MMP2 1.13±0.09 0.63±0.051）1.09±0.10 1.48±0.122）125.169 0.000 MMP9 0.95±0.08 0.50±0.041）0.98±0.11 1.28±0.102）123.698 0.000 OD450 1.248±0.10 0.658±0.051）1.276±0.11 1.418±0.132）98.131 0.000 Cell migration number 174.25±11.18 81.56±7.051）172.13±13.29 199.25±15.232）164.642 0.000 Cell invasion number 151.08±11.52 61.13±5.061）148.69±10.08 172.19±13.022）203.257 0.000

圖2 Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detects expressions of MMP2 and MMP9 proteins

2.5 下調(diào)miR-34a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響 與馬錢子堿高劑量組相比，馬錢子堿高劑量+anti-miR-34a-5p組HeLa細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，表5、圖3）。

表5 anti-miR-34a-5p逆轉(zhuǎn)馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.5 anti-miR-34a-5p reversed effect of brucine on activity，migration and invasion of IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

表5 anti-miR-34a-5p逆轉(zhuǎn)馬錢子堿對IL-6處理的HeLa細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.5 anti-miR-34a-5p reversed effect of brucine on activity，migration and invasion of IL-6-treated HeLa cells（±s，n=9）

Note：Compared with Brucine high-dose+anti-miR-NC，1）P＜0.05.

Groups Brucine high-dose Brucine high-dose+anti-miR-NC Brucine high-dose+anti-miR-34a-5p F P 1.00±0.11 1.02±0.10 0.45±0.041）119.203 0.000 0.44±0.04 0.42±0.03 0.78±0.071）149.351 0.000 0.50±0.05 0.52±0.04 0.86±0.081）105.257 0.000 0.551±0.06 0.549±0.04 0.831±0.071）70.364 0.000 92.46±8.02 93.68±7.46 161.29±12.041）158.137 0.000 80.27±6.76 78.34±6.25 131.53±10.071）131.992 0.000 miR-34a-5p MMP2 MMP9 OD450 Cell migration number Cell invasion number

圖3 Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot detects MMP2，MMP9 proteins expressions

2.6 Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá) 與NC組相比，IL-6組HeLa細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與IL-6組相比，馬錢子堿高劑量組HeLa細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與馬錢子堿高劑量+anti-miR-NC組相比，馬錢子堿高劑量+anti-miR-34a-5p組HeLa細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖4、表6）。

表6 Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)（±s，n=9）Tab.6 Expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway proteins（±s，n=9）

表6 Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)（±s，n=9）Tab.6 Expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway proteins（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P＜0.05；compared with IL-6，2）P＜0.05；compared with brucine+anti-miR-NC，3）P＜0.05.

Groups NC IL-6 Brucine high-dose Brucine high-dose+anti-miR-NC Brucine high-dose+anti-miR-34a-5p F P β-catenin 0.88±0.07 1.09±0.101）0.51±0.052）0.48±0.04 0.93±0.083）129.100 0.000

圖4 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detects β-catenin protein expression

3 討論

馬錢子堿是馬錢子主要生物堿單體，相較于士的寧、馬錢子堿氮氧化物等其他馬錢子生物堿成分具有較高抗腫瘤活性，且毒性遠(yuǎn)低于士的寧，是近年抗腫瘤研究熱點。XU等［10］及LI等［11］研究顯示，馬錢子堿呈劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移、侵襲和黏附能力，抑制生成擬態(tài)形成。田龍夫等［12］研究報道，馬錢子堿可能通過線粒體凋亡途徑上調(diào)促凋亡蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞凋亡。李邐等［13］證實馬錢子堿通過調(diào)節(jié)IL-6/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞STAT3磷酸化激活，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究以IL-6誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，探討馬錢子堿對宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿作用后，IL-6誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞活力顯著降低，且呈劑量依賴性。MMP2和MMP2是降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要酶類，本研究發(fā)現(xiàn)高濃度馬錢子堿作用后IL-6誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力、MMP2和MMP2蛋白表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步說明馬錢子堿在宮頸癌中的抗腫瘤作用，與既往研究結(jié)論一致［5］。馬錢子堿可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，有望用于宮頸癌防治。

miR-34a-5p屬于miR-34家族，對宮頸癌、乳腺癌等多種癌癥中的抑制作用已被廣泛報道［14］。研究顯示，miR-34a通過靶向E2F轉(zhuǎn)錄因子3（E2F transcription factor 3，E2F3）和調(diào)節(jié)生存素Survivin表達(dá)降低人乳頭瘤病毒陽性宮頸癌細(xì)胞的生存和侵襲能力［15］。此外，miR-34a-5p通過靶向抗凋亡基因Bcl-2對卵巢癌細(xì)胞、腦膜瘤細(xì)胞具有顯著抗增殖和促凋亡作用［16-17］。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，IL-6誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力顯著降低，而下調(diào)miR-34a-5p表達(dá)可增強(qiáng)IL-6誘導(dǎo)對HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用，提示miR-34a-5p在宮頸癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。研究指出，miR-34a-5p在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)降低，木犀草素通過上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可降低HeLa細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)，而馬錢子堿可提高IL-6誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)，提示馬錢子堿可能通過上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-34a-5p表達(dá)可減輕馬錢子堿對IL-6誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，進(jìn)一步說明馬錢子堿通過上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)在宮頸癌中發(fā)揮抗增殖、抗遷移侵襲作用。

Wnt/β-catenin信號通路宮頸癌中異常激活參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過程，抑制Wnt/β-catenin信號通路已成為宮頸癌治療的重要策略［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿可降低IL-6誘導(dǎo)后HeLa細(xì)胞中β-catenin表達(dá)，下調(diào)表達(dá)miR-34a-5p可減輕馬錢子堿對IL-6誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響，提示馬錢子堿的抗宮頸癌作用可能與上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)和抑制Wnt/βcatenin信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實馬錢子堿可抑制IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)和抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，為馬錢子堿用于臨床宮頸癌治療提供理論基礎(chǔ)。