黃芪多糖對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脾細胞的免疫調節作用研究①

劉建春 張紅珍 李俊蓮 樊慧杰 柴 智 尉杰忠 于婧文 肖保國 馬存根⑤

（山西中醫藥大學神經生物學研究中心，晉中030619）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種主要發生于青壯年人的中樞神經系統（central nervous system，CNS）的慢性、進展性、致殘性的自身免疫性疾病。氧化應激、炎癥加重和隨后引發的髓鞘脫失、神經元變性是MS的重要特征［1-2］。近年來，據MS國際基金會的統計在全球范圍內約有300萬MS患者，且發病率有逐年上升的趨勢。西醫治療MS多采用抗炎和免疫調節等方法，但預后差，且藥物價格昂貴，需長期使用，帶來的副作用也將日趨加重，這給患者的家庭和社會帶來了巨大的精神和經濟壓力［3］。因此，有效防治神經炎癥病變MS的社會需求越來越迫切。

在延緩MS疾病進程方面，中醫藥與西藥相比，具有辨證論治、整體調節等特點，理應在MS的預防和治療中發揮其獨特優勢［4］。中醫學，根據臨床表現不同，分別歸屬“痿證”“內障”“眩暈”等不同的病名。辨證分型中臨床常見證型之一是氣虛血瘀證，依據病機辨證論治，治療則應以補氣活血兼以祛瘀通絡為主［5-6］。

山西省道地藥材之一黃芪，在古代醫書中有“補藥之長”的美譽，具有補氣升陽、生津養血等功效。藥理研究發現，黃芪中的主要有效成分黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS），具有增強免疫、抗氧化、抗炎、抗衰老等多種作用，能夠有效治療和改善多種神經系統相關疾病及神經損傷的癥狀［7］。本研究發揮中醫藥優勢，應用APS干預免疫后第9天多發性硬化實驗動物模型——實驗性自身免疫性腦 脊 髓 炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠的脾細胞，探討APS對致腦炎癥脾細胞的免疫調節作用及機制，以期為臨床開發和應用APS治療多發性硬化等神經系統變性疾病提供藥理學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物8～10周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠，實驗前小鼠自由飲食喂養1周。

1.1.2 試劑APS（上海愛必信生物科技有限公司）；小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白多肽35-55（myelin oligodendrocyte glycoproten，MOG35-55，上海強耀生物科技有限公司）；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX，Sigma公司）；結核分枝桿菌（tuberculosis mycobacter ium，TB，Becton Dickinson公司）；完全弗氏佐劑（complete freund's adjuvant，CFA，Alexis公司）；流式抗體LAP（TGF-β）Antibody、PE Anti-mouse CD25 Antibody、PE Anti-mouse-IL-12、FITC Anti-mouse CD4 Antibody（Biolegend公 司）；Flour-488-CD11b、PE-CD16/32和PE-CD206（Becton Dick-inson公司）；IFN-γ、IL-12及IL-10 ELISA試劑盒（R&D公司）；熒光素染料（carboxyfluoresceinsuccinimidyl amino ester，CFSE，碧云天公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo公司）；DMEM高糖培養基（Gibco公司）；胎牛血清（HyClone公司）。

1.1.3 儀器CO2培養箱及全波長酶標儀（Thermo公司）；多用途低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；FACS Calibur流式細胞儀（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型制備MOG35-55抗原乳劑的配制和注射的方法均嚴格按照文獻［8］進行。用生理鹽水配制MOG35-55水劑，在完全弗氏佐劑中加入TB配制油劑，將水劑和油劑按等體積的比例混合，反復抽推混合液制備油包水樣抗原混懸液。在每只小鼠腰骶膨大處脊柱兩側皮下分4點注射抗原乳劑0.1 ml，將注射的當天記為免疫后的第0天。于免疫的當天和48 h后，每只小鼠腹腔注射PTX 300 ng以增強小鼠的免疫應答［9］。

1.2.2 取材及脾細胞制備 在免疫后的第9天，麻醉小鼠，無菌操作條件下剪開腹部，取出脾，然后放入預冷的DMEM高糖培養液中，在超凈工作臺中采用注射器針芯研磨脾臟，直至組織發白，過濾后，1 500 r/min離心10 min，倒掉上清液，重懸細胞，加入滅菌的雙蒸水4 ml，45 s后加入2 ml 2.7%NaCl溶液恢復到等滲狀態，去除破碎的細胞膜，1 500 r/min離心10 min后，倒掉上清，拍打重懸細胞，制備成單個核細胞的懸液，細胞計數后備用。

1.2.3 脾細胞培養 實驗分3組：EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組。每組取2個50 ml離心管向其中加入含相同數量脾細胞（5×106個/ml）的完全培養液5 ml，加入MOG35-55，使其含量為10 μg/ml。APS低劑量組、APS高劑量組加入相同體積相應濃度的APS，使其終濃度分別為0.1 mg/ml、0.2 mg/ml，EAE組加入相同體積的PBS，37℃、5%CO2培養箱常規培養48 h，收集上述細胞及上清液。

1.2.4 流式細胞術檢測脾中T淋巴細胞及巨噬細胞表型的表達 將EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組收集的脾細胞懸浮于1% BSA中，分裝于流式管中，每管50 μl，分別加相應的流式抗體，室溫避光20 min。PBS洗滌2次各加400 μl PBS，用流式細胞儀檢測CD4+CD25+、CD4+TGF-β+、CD4+IFN-γ+、CD11b+CD206+及CD11b+CD16/32+細胞的變化。

1.2.5 ELISA法測定脾上清中IL-10、IL-12、IFN-γ的水平 取EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組收集的脾細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀檢測各組細胞上清液中IL-10、IL-12和IFN-γ的吸光度值，根據直線回歸方程計算所測細胞因子的含量。

1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖 分別取EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組培養48 h后的脾細胞懸液鋪96孔板，每組設3個復孔，每孔加樣量為100 μl。按照說明書，在每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37℃培養箱內孵育4 h。用酶標儀檢測在450 nm處的吸光度值。

1.2.7 CFSE檢測細胞增殖 從制備好的單個核脾細胞懸液中取出含6×106個的脾細胞懸液置于4 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌3次，加入2 ml PBS重懸細胞，用CFSE標記，置于37℃、5%CO2培養箱中培養15 min，然后加入等體積胎牛血清終止反應，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，加入含10 μg/ml MOG35-55的完全培養液2 ml重懸細胞。鋪96孔板，分EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組，每組3個復孔，每孔加200 μl。EAE組加PBS，APS低劑量組、APS高劑量組加APS，使其終濃度分別為0.1 mg/ml、0.2 mg/ml。置于37℃、5%CO2培養箱中培養72 h，上流式細胞儀檢測CFSE的熒光強度。

1.3 統計學分析 采用Graph Pad Prism 5.0統計分析軟件進行相關數據處理，計量數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APS對CD4+T細胞亞群及巨噬細胞表型表達的影響 與EAE組比較，APS高劑量、低劑量均可上調CD25+、TGF-β+的CD4+T細胞的表達（P＜0.001，P＜0.05）；APS高劑量可下調IL-12+的CD4+T細胞的表達（P＜0.01），APS低劑量也下調IL-12+的CD4+T細胞的表達，但無統計學意義（圖1）。與EAE組相比，APS低劑量可顯著增加M2型巨噬細胞表面標志CD206的表達（P＜0.001），APS高、低劑量均可顯著抑制M1型巨噬細胞表面標志CD16/32+的表達（P＜0.001，圖2）。

圖1 APS調節CD4+T細胞比例Fig.1 APS regulated polarization of CD4+T cells

圖2 APS調節脾中M1型和M2型巨噬細胞比例Fig.2 APS regulate proportion of M1 and M2 macrophages in spleen

2.2 APS對脾上清中細胞因子表達水平的影響 與EAE組比較，APS低劑量可使脾細胞上清液中IL-10分泌增高，IL-12分泌降低（P＜0.05）；APS高劑量有使IL-12、IFN-γ分泌降低，IL-10分泌增加的趨勢（圖3）。

圖3 APS對脾上清中細胞因子表達水平的影響Fig.3 Effect of APS on cytokine expression in spleen supernatant

2.3 APS對脾細胞增殖率的影響 分別用CCK-8法和CFSE法檢測APS對脾細胞增殖率的影響，結果顯示，與EAE組比較，APS高、低劑量均可使脾細胞增殖率明顯上升（P＜0.01，P＜0.001，圖4）。

圖4 APS對脾細胞增殖率的影響Fig.4 Effect of APS on proliferation rate of spleen cells

3 討論

MS是一種自身免疫性疾病。免疫失衡是MS最主要的發病機制［10-11］。由于免疫紊亂，反應性T細胞，特別是CD4+T細胞進入中樞神經系統，通過釋放細胞因子如IL-6、IL-1β等，趨化B淋巴細胞和巨噬細胞，B淋巴細胞分泌抗體標記在髓鞘上，巨噬細胞利用抗體標志吞噬摧毀少突膠質細胞，導致髓鞘脫失，這種免疫攻擊是發作式的，長期下去，軸突變性，中斷神經元之間的交流，最終導致認知、運動等障礙［12-13］。

在MS/EAE中，中樞神經系統炎癥浸潤主要由反應性T細胞和活化的巨噬細胞引起。脾是兩種細胞的蓄水池，它們首先在脾中被激活和增殖。隨后，通過血循環進入脊髓［14］。初始CD4+T細胞在受到抗原的刺激后，在不同的條件下可分化成Th1、Th2和調節性T細胞（Treg）等不同的亞群，分泌不同的細胞因子，執行不同的功能［15］。Th1細胞主要分泌IFN-γ，TNF-α，IL-12，介導針對細胞內病原微生物的細胞免疫，被稱為炎癥T細胞，IFN-γ，IL-12促進Th1分化，而IL-4、IL-10和TGF-β抑制Th1分化。在EAE中，Th1細胞在CNS內通過促進炎癥介質的釋放，誘發脫髓鞘，使EAE加重。Th2細胞可通過分泌IL-4、IL-5、IL-13，促進機體的體液免疫。Th2細胞有拮抗Th1細胞的作用，呈現出與免疫調節、減輕炎癥反應相關的作用，在EAE的脫髓鞘病變過程中發揮保護作用［16-18］。Th1/Th2細胞間的動態平衡可能在MS疾病轉歸過程中起著重要的作用。實驗研究采用體內注射MOG35-55后第9天獲得一群致腦炎癥脾細胞，在細胞水平上研究APS的免疫調節作用。結果表明，APS能顯著增加CD25+、TGF-β+的CD4+T細胞亞群的比例，下調IL-12+的CD4+T細胞的表達，使脾細胞上清液中IL-10分泌增高，IL-12分泌降低，表明APS可以調節Th1和Th2細胞介導的免疫再平衡。

巨噬細胞來源于血液中的單核細胞，在維持組織器官內環境穩態，抗病原體感染等方面起著重要的作用［19］。巨噬細胞在生理和病理條件下均表現出極大的異質性。在不同的微環境下可極化為M1型和M2型［20］。M1型巨噬細胞可分泌大量炎癥介質IL-1β、IFN-γ、TNF-α以促進繼發性損傷過程［21-22］；而M2型巨噬細胞通過分泌抗炎因子IL-10、IL-13和TGF-β等對抗受損區域的炎癥反應，重新建立穩態，同時可產生一系列生長因子，促進少突膠質細胞損傷后的髓鞘修復［23-25］。可見，巨噬細胞的極性對EAE疾病的改善或進展具有很大的影響。實驗發現，APS可顯著抑制M1型巨噬細胞表面標志CD16/32+的表達，增加M2型巨噬細胞表面標志CD206+的表達，使M1型向M2型轉化，改善EAE的炎癥反應的微環境。

綜上所述，APS對致腦炎癥脾細胞可通過調節抗炎和致炎免疫細胞的比例，調整細胞因子的含量，發揮免疫調節作用，提示APS具有治療EAE的潛能。