NLRP3炎癥小體在甲型流感病毒肺炎小鼠肺組織的表達水平及其介導的炎癥反應①

石云鋒 師小函 梁晶晶 陳健寧 江振友 吳本權（中山大學附屬第三醫院，廣州510630）

甲型流感病毒（甲流病毒）引起流行性感冒為主的呼吸系統急性感染性疾病，但病毒性肺炎在甲型流感大流行時發病率明顯增高，并且在病程1周時易進展為重癥病毒性肺炎或繼發細菌性肺炎，病死率高［1-2］。甲流病毒感染激活肺泡巨噬細胞等免疫細胞中的NOD樣受體蛋白3（NOD like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，后者引起IL-1β、IL-18的釋放并介導炎癥反應，該免疫反應是機體抗甲流病毒感染的主要機制［3］。在甲流病毒肺炎早期，NLRP3炎癥小體的激活及介導的炎癥反應有助于病毒的清除［4］。但在甲流病毒肺炎病程1周時，即進展至重癥肺炎的高風險時期，NLRP3炎癥小體具體活性如何，國內外未見深入研究。本研究以甲流病毒鼠肺適應株H1N1/FM1滴鼻感染C57BL/6小鼠建立肺炎模型，探索NLRP3、caspase-1、IL-1β的表達水平以及相應的炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗病毒及動物 甲流病毒H1N1/FM1株為鼠肺適應株，前期研究證實其引起小鼠病毒性肺炎的致病力［5］。C57BL/6小鼠15只，雄性，鼠齡30～35 d，購于廣東省實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物實驗過程遵循《赫爾辛基宣言》相關原則及動物倫理要求。

1.1.2 主要試劑MLV第一鏈合成試劑盒、SYBR?select master mix購于美國Life Technologies公司；RT qPCR引物由美國Life Technologies公司設計并合成；NLRP3單克隆兔抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；caspase-1單克隆兔抗體購于美國Novus Biologicals公司；GAPDH兔抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、全蛋白提取試劑盒及BCA法蛋白濃度檢測試劑盒購于廣州杰特偉科技有限公司；ELISA試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 甲流病毒H1N1復蘇、毒力測定 復蘇液氮罐中凍存的甲流病毒H1N1/FM1株，于9日齡雞胚尿囊腔連續傳代2次擴增后，以雞紅細胞血凝試驗測定擴增的病毒效價。用無血清DMEM培養液對H1N1/FM1病毒株行連續2倍遞次稀釋至1∶1 280。確定病毒效價為1∶640及半數致死量（LD50）為2-2.83/50 μl。

1.2.2 甲流病毒H1N1滴鼻建立小鼠肺炎模型及分組 小鼠飼養1周后開始實驗，隨機分成空白對照組、24 h組和1周組，每組5只。腹腔注射10%水合氯醛80 μl麻醉小鼠后，空白對照組每只小鼠以50 μl PBS液滴鼻，24 h組及1周組每只小鼠以50 μl LD50濃度的甲流病毒H1N1滴鼻建立甲流病毒肺炎模型。24 h組感染24 h，1周組感染168 h（1周）。觀察并記錄小鼠的生存狀況、一般情況、體重等。體重變化率（%）=（實驗點體重-初始體重）/初始體重×100%。

1.2.3 標本取材 在各實驗點，眼眶取血后頸椎脫臼法處死小鼠。分離血清，用于IL-1β濃度ELISA檢測。摘取小鼠肺臟，左肺上葉和下葉分別留作提取蛋白和RNA，右肺留作病理切片和HE染色。

1.2.4 RT-qPCR檢測肺組織NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA轉錄水平 將各組小鼠肺組織稱重后研磨制成懸液。用Trizol法提取組織總RNA，檢測RNA的濃度。應用ABI7500系統行PCR檢測。反應條件為：50℃2 min、95℃2 min預變性，95℃15 s變性，60℃1 min退火，95℃15 s、60℃1 min、95℃30 s、60℃15 s延伸，共進行40個循環。記錄目的基因與內參基因的Ct值，用2-ΔΔCt計算目的基因mRNA的相對表達量。RT-qPCR反應引物見表1。

表1 NLRP3、caspase-1和IL-1β的引物序列Tab.1 Primer sequences of NLRP3，caspase-1 and IL-1β

1.2.5 Western blot檢測肺組織NLRP3、caspase-1的蛋白表達水平 裂解小鼠肺組織后，提取總蛋白。按凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書，測定蛋白濃度。按Western blot步驟，轉膜，封閉，給予相應的一抗、二抗孵育，在Chemi Scope化學發光成像系統顯影，用Image J軟件分析目的蛋白及內參蛋白的灰度值，計算各目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 ELISA檢測血清IL-1β的濃度 根據ELISA檢測試劑盒的操作流程，設復孔數為3，取測量數據的平均值，依據標準曲線計算各組小鼠血清IL-1β的濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS Statistics 20.0軟件進行統計分析。數據均符合正態分布，以±s表示，多組間比較選用單因素方差分析，兩組間比較滿足方差齊性的選擇LSD-t檢驗，兩組間比較方差不齊的選擇Dunnett T3檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠生存狀況及一般情況 各組小鼠均全部存活。空白對照組小鼠進食、活動如常，24 h后及1周后平均體重分別增加3.98%和10.54%。24 h組及1周組小鼠均出現精神萎靡、豎毛、毛色無光澤、攝食量下降、活動減少等情況。24 h組平均體重減輕6.78%，1周組在24 h后及1周后平均體重分別減輕4.31%與19.28%。

2.2 小鼠肺組織病理及肺炎模型的建立 空白對照組小鼠肺組織病理切片示正常肺組織，支氣管壁完整，肺泡內及組織間隙無明顯腫脹，無明顯炎癥細胞浸潤。24 h組小鼠肺組織見局灶性支氣管炎和彌散性間質肺炎，見較多的炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，肺泡結構破壞。1周組小鼠肺組織病理可見炎癥反應較24 h組加重，炎癥細胞浸潤及充血更加明顯，并可見局灶性實變（圖1）。

圖1 甲流病毒H1N1感染致小鼠肺炎組織病理改變Fig.1 Pathology of pneumonia caused by IAV H1N1 infection in mice

2.3 小鼠肺組織NLRP3、caspase-1的mRNA及蛋白相對表達量RT-qPCR檢測發現甲流病毒肺炎小鼠肺組織NLRP3的mRNA表達明顯升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統計學意義（F=221.051，P＜0.05，圖2）。caspase-1的mRNA表達水平也升高，1周組比空白對照組、24 h組升高，差異有統計學意義（F=116.656，P＜0.01，圖2）。Western blot檢測發現甲流病毒肺炎小鼠肺組織NLRP3的蛋白表達水平明顯升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統計學意義（F=1 194.353，P＜0.01，圖3），此變化趨勢與mRNA表達水平的結果相一致。caspase-1的蛋白表達水平明顯升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統計學意義（F=173.997，P＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot檢測甲流病毒肺炎小鼠肺組織NLRP3與caspase-1的蛋白相對表達量Fig.3 Protein levels of NLRP3 and caspase-1 in IAV pneumonia in mice measured by Western blot

2.4 小鼠肺組織IL-1β的mRNA相對表達量及血清IL-1β濃度RT-qPCR檢測發現甲流病毒肺炎小鼠肺組織IL-1β的mRNA表達升高，24 h組、1周組均較空白對照組升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統計學意義（F=439.687，P＜0.01，圖4A）。ELISA檢測發現甲流病毒肺炎小鼠血清IL-1β濃 度 升 高，24 h組（189.486±2.268）、1周 組（219.010±2.577）均 較 空 白 對 照 組（152.190±6.908）升高，1周組比24 h組升高，組間比較差異均有統計學意義（F=169.575，P＜0.01，圖4B）。

圖4 甲流病毒肺炎小鼠肺組織IL-1β的mRNA相對表達量和血清IL-1β濃度Fig.4 Relative mRNA expression level and serum concentrations of IL-1β in IAV pneumonia in mice

3 討論

甲流病毒感染呼吸系統引起流行性感冒、支氣管炎、肺炎等疾病。甲流病毒通過感染并破壞呼吸道上皮細胞，直接引起肺損害。此外，甲流病毒的RNA、M2蛋白等結構成分激活肺泡巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞，引起炎癥反應間接加劇肺損傷［1］。甲流病毒感染的預后取決于病毒負荷量、炎癥反應強度以及有無繼發感染［6］。流行性感冒有自限性的特點，感染1周時間是炎癥反應的高峰期，固有免疫及體液免疫相繼激活后病毒清除及病情緩解［7］。但甲流病毒肺炎在感染1周時易進展為重癥病毒性肺炎，或者繼發細菌性肺炎，該病理狀況是甲流病毒感染者臨床死亡的主要原因［8］。

肺泡巨噬細胞數量占肺泡灌洗液中細胞成分的80%，是介導甲流病毒感染引起炎癥反應最重要的效應細胞［9］。而肺泡巨噬細胞表達的NOD樣受體（NOD like receptor，NLRs）及其活性形式炎癥小體，是其抗甲流病毒免疫的主要機制［3，10］。

NLRP3炎癥小體是抗甲流病毒免疫炎癥小體的主要成員，其結構成分包括NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）與半胱天冬酶1（caspase-1），以NLRP3為核心結構。NLRP3炎癥小體抗甲流病毒免疫過程包含兩條信號通路。信號通路1為Toll樣受體17（TLR17）識別甲流病毒RNA及M2蛋白，通過NFκB途徑，誘導NLRP3、caspase-1以及IL-1β基因的表達，生成NLRP3、caspase-1以及pro-IL-1β。信號通路2為NLRP3炎癥小體三聚體形成，自剪切無活性的caspase-1為活化的cleaved-caspase-1，cleavedcaspase-1剪切pro-IL-1β為活性的IL-1β并分泌出細胞外［4］。IL-1β作為炎癥反應上游的細胞因子，促進炎癥反應并清除病原體［11-12］。

對NLRP3炎癥小體初期的研究認為，NLRP3炎癥小體在抗甲流病毒免疫中被激活并引起炎癥反應，對機體起保護作用［13-14］。本實驗發現，與空白對照組比，24 h組NLRP3、caspase-1的mRNA表達及蛋白表達均增強，IL-1β的mRNA表達及血清濃度也升高，表現出NLRP3炎癥小體信號通路1以及信號通路2均活化。24 h組小鼠肺組織病理示輕度炎癥反應。該部分研究結果驗證了NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎的早期即被激活并促進炎癥反應，而適度的炎癥反應有助于病毒的清除，該結論與主流的研究相一致。

但近年越來越多研究認為，在甲流病毒感染1周后，NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應對機體是有害的［15-16］。JIA等［17］發現，在甲流病毒肺炎后期加用奧司他韋聯合西羅莫司，有助于減輕肺損害，而該效應是由奧司他韋與西羅莫司抑制了NLRP3炎癥小體的活性介導的。因此，有觀點認為，抑制NLRP3炎癥小體信號通路從而減輕劇烈的炎癥反應是甲流病毒肺炎治療的新方向［18-19］。ZHANG等［20］研究發現，在甲流病毒肺炎的病程中，存在兩波炎癥細胞因子的高峰，第二波炎癥細胞因子的高峰在病程7 d左右，但該研究未進一步研究其機制。本研究結果顯示，在甲流病毒肺炎的1周時間，NLRP3及caspase-1的表達比早期進一步升高，IL-1β的轉錄及分泌也進一步增強，實驗小鼠的健康狀況及肺炎病理亦證實炎癥反應在1周時明顯加重。血清IL-1β濃度體現的是全身性的炎癥反應水平，該結果支持了ZHANG等的研究發現，NLRP3炎癥小體在感染1周時的進一步激活可能參與了第二波炎癥細胞因子高峰的機制。本研究結果也與臨床工作觀察到的甲流病毒肺炎病例在感染1周后進展為重癥病毒性肺炎或繼發細菌性肺炎的現象相一致。NLRP3炎癥小體在感染1周時的進一步激活及其介導的炎癥反應可能是甲流病毒肺炎進展為重癥病毒性肺炎的機制之一。

綜上所述，本研究驗證了NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎小鼠肺組織的表達水平及其介導的炎癥反應，感染1周后NLRP3炎癥小體的表達水平及小鼠肺組織炎癥反應比肺炎早期明顯增強，推斷該效應可能是甲流病毒肺炎進展為重癥病毒性肺炎的機制之一。同時，NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎的具體作用以及與其他的信號通路的關系，都有待更深入的研究，這是本實驗的局限與展望。