基于JAK/STAT通路EFhD2蛋白對肺癌大鼠T淋巴細胞免疫功能的調節作用研究①

翟占強 江立群 朱 佳 張典鈿 湯靈玲（浙江省榮軍醫院胸部疾病診療中心，嘉興314000）

肺癌是呼吸系統常見惡性腫瘤，近年來隨著環境惡化發病率不斷升高，已成為21世紀嚴重威脅人類生命健康的疾?。?］。目前肺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，患者確診時多數已致中晚期，手術及放化療效果不佳，治療期間器官功能受損、腫瘤耐藥等不良反應導致病死率居高不下［2-3］。因此，探討肺癌發生發展機制，尋找有效治療靶點提高機體免疫力、抑制腫瘤生長有積極意義。螺旋-環-螺旋拓撲結構域蛋白D2（helix-loop-helix topology protein D2，EFhD2）又稱Swiprosin-1，主要存在于人淋巴細胞、B細胞及其他免疫細胞［4］。近年來研究表明，EFhD2在免疫細胞激活、細胞毒作用、癌細胞增殖及遷移等多種生物學活動中發揮重要調控作用，但具體調控機制不明［5］。為此，本研究通過建立大鼠肺癌模型，觀察抑制或激活EFhD2蛋白的表達對肺癌大鼠T淋巴細胞免疫功能的調控作用，并探討其調控機制，為臨床中肺癌靶向治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠，75只，雌雄各37只、38只，8周齡，體重（180±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號SCXK（京）2019-0008，使用許可證號SYXK（京）2019-0022。飼養于12 h/12 h明暗交替、60%濕度、23～25℃溫度條件下，自由進食和飲水，實驗開展前適應性飼養1周，實驗過程中符合減少、替代和優化的3R原則。實驗動物倫理審批號：IACUC-20190101-02。

1.1.2 主要試劑與儀器 含EFhD2基因短發卡樣RNA（shRNA-EFhD2）和模擬物RNA（mimic-EFhD2）的重組腺病毒載體（病毒滴度1×1010PFU/ml，由上海英駿生物技術有限公司測序及病毒包裝）；三甲基膽蒽、二乙基亞硝胺（美國Sigma公司）；碘化油注射液（煙臺魯銀藥業有限公司，國藥準字H37022398，規格10 ml）；CD3+、CD4+、CD8+細胞檢測試劑盒（杭州安捷倫生物有限公司）；兔抗大鼠EFhD2、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、信號轉導與轉錄激活子3（signal transduction and transcription activator 3，STAT3）、p-STAT3單抗（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二抗（美國Thermo Fisher公司）；FACSCalibur分析型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌模型建立75只大鼠隨機取60只采用氣管內灌注致癌碘油液法建立大鼠肺癌模型，參考文獻［6］肺癌模型建立大鼠肺癌模型：造模前3 d肌注2萬單位青霉素、50 mg鏈霉素預防肺部感染；60只Wister大鼠腹腔注射戊巴比妥那麻醉后，仰臥位固定于手術臺，額鏡直視下左肺支氣管灌注0.1 ml致癌碘油液（1.2 g三甲基膽蒽、1.6 ml二乙基亞硝胺與6.4 ml碘油混合后取0.1 ml），對照組同法灌注0.1 ml碘油。灌注結束后分籠飼養，自由進食和飲水。

1.2.2 分組及干預 大鼠灌注成功后隨機分為模型 組、sh-EFhD2組、EFhD2組、EFhD2-AG490組，15只/組。其余15只大鼠采用同法灌注碘油，設為對照組。灌注成功后次日開始干預：sh-EFhD2組、EFhD2組分別尾靜脈注射shRNA-EFhD2、mimic-EFhD2重組腺病毒載體（病毒滴度1×1010PFU/ml）100 μl，10 min后尾靜脈注射100 μl生理鹽水；EFhD2-AG490組尾靜脈注射100 μl mimic-EFhD2重組腺病毒載體后10 min，尾靜脈注射0.25 mg JAK2抑制劑AG490 100 μl；模型組和對照組尾靜脈注射等量生理鹽水；每周干預1次，共干預8周。干預期間觀察大鼠一般情況。本研究所有大鼠均進行病理組織學檢查明確肺癌建模成功，未建模成功大鼠予以剔除。

1.2.3 外周血T淋巴細胞亞群檢測 末次干預后24 h，2%戊巴比妥那腹腔麻醉各組大鼠，腹主動脈采 血1 ml，取50 μl抗 凝 血，加 入 含10 μl CD3+、CD4+、CD8+單抗的離心管中，冰上孵育30 min，加入紅細胞裂解液，混勻，避光冰上繼續孵育10 min，加入PBS洗滌3次，3 000 r/min離心8 min，取沉淀，用2%多聚甲醛固定，PBS重懸后，1 h內采用流式細胞分析儀分析T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比，并計算CD4+/CD8+。

1.2.4肺指數、脾臟指數計算及組織取材 各組于采血前稱取體重，采血結束后立即脫頸處死，解剖大鼠取肺、脾臟，以組織質量/體重為肺指數和脾臟指數。各組取5只大鼠肺腫瘤組織置于10%中性甲醛固定備用，另取5只大鼠肺腫瘤組織置于-80℃保存備用。

1.2.5 肺組織病理觀察 取置于10%中性甲醛固定24 h的肺腫瘤組織，梯度乙醇脫水、二甲苯固定后，進行石蠟包埋及常規連續切片（厚度為5 μm），進行常規HE染色，中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察肺組織病變情況。

1.2.6 EFhD2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達量檢測 取保存于-80℃的肺腫瘤組織約50 mg，加入液氮研磨，轉移至離心管，加入1 ml細胞裂解液，冰上孵育25 min，12 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm，取上清液進行BCA蛋白定量；取40 μg待測蛋白與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴8 min使蛋白變性，再次離心后取上清液，進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉儀將蛋白轉印至硝酸纖維素膜，將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBST洗滌10 min×3次，加入封閉液稀釋一抗［EFhD2（1∶500），JAK2、p-JAK2（1∶300），STAT3、p-STAT3（1∶500）］，4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入封閉液稀釋的HRP標記的二抗（1∶5 000），室溫繼續孵育1 h，于暗室中曝光、顯影，各條帶掃描拍照后，采用圖像分析軟件Image J軟件進行灰度值分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，多樣本資料比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠造模一般情況觀察 對照組大鼠試驗期間進食、飲水、活動等一般情況均正常；模型組于建模次日開始進食、飲水減少，喜臥、毛發無光澤等表現，隨時間延長逐漸出現呼吸加快、咳嗽增多并伴呼吸困難；EFhD2組上述癥狀和體征較模型組更為嚴重，至實驗結束時多數處于垂死狀態；sh-EFhD2組上述癥狀和體征較模型組明顯減輕；EFhD2-AG490組上述癥狀和體征較模型組嚴重，但較EFhD2組減輕。

2.2 肺組織病理形態觀察 模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組、EFhD2-AG490組各有13、10、15、11只誘發肺鱗狀細胞癌，納入后續實驗。模型組剩余2只為非典型增生，sh-EFhD2組剩余3只非典型增生、2只增生，EFhD2-AG490組剩余3只均非典型增生，1只增生。

對照組大鼠肺組織結構正常，未見明顯病變；模型組支氣管黏膜上皮細胞磷狀化生，腫瘤細胞排列紊亂，伴有較多炎癥細胞浸潤；sh-EFhD2組較模型組明顯減輕；EFhD2組上述病變較模型組更為嚴重，伴有肺泡囊擴張，氣管黏膜充血，組織腫脹等；EFhD2-AG490組上述病變較EFhD2組減輕。見圖1。

圖1 肺組織病理學染色（HE，×400，n=5）Fig.1 Pathological staining of lung histopathology（HE，×400，n=5）

2.3 外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+比較 外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組CD3+、CD4+占比及CD4+/CD8+均降低，且CD3+、CD4+占比EFhD2組＜EFhD2-AG490組＜模型組＜sh-EFhD2組，CD4+/CD8+EFhD2組＜模型組和EFhD2-AG490組＜sh-EFhD2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組相 比，模 型 組、sh-EFhD2組、EFhD2組 及EFhD2-AG490組CD8+占比升高，且EFhD2組＞模型組和EFhD2-AG490組＞sh-EFhD2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+比較（±s，%）Tab.1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD8+ratio and CD4+/CD8+（±s，%）

表1 外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比及CD4+/CD8+比較（±s，%）Tab.1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD8+ratio and CD4+/CD8+（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with sh-EFhD2 group，3）P＜0.05；compared with EFhD2 group，4）P＜0.05.

Groups Control Model sh-EFhD2 EFhD2 EFhD2-AG490 n 15 13 10 15 11 CD3+64.16±2.90 48.30±1.781）57.24±2.211）2）43.02±2.351）2）3）46.37±2.621）2）3）4）CD4+45.80±2.11 31.25±1.801）40.71±2.321）2）27.20±2.071）2）3）29.44±1.951）2）3）4）CD8+21.33±2.35 30.06±2.171）25.69±2.101）2）32.87±2.821）2）3）30.44±2.921）3）4）CD4+/CD8+2.15±0.13 1.04±0.091）1.58±0.111）2）0.83±0.091）2）3）0.97±0.101）3）4）

2.4 肺指數、脾臟指數比較 肺指數、脾臟指數組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組肺指數較高，且EFhD2組＞模型組和EFhD2-AG490組＞sh-EFhD2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與對照組相比，模型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組脾臟指數較低，且EFhD2組＜模型組和EFhD2-AG490組＜sh-EFhD2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 肺指數、脾臟指數比較（±s，mg/g）Tab.2 Comparison of lung index and spleen index（±s，mg/g）

表2 肺指數、脾臟指數比較（±s，mg/g）Tab.2 Comparison of lung index and spleen index（±s，mg/g）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with sh-EFhD2 group，3）P＜0.05；compared with EFhD2 group，4）P＜0.05.

Groups Control Model sh-EFhD2 EFhD2 EFhD2-AG490 n 15 13 10 15 11 Lung index 2.94±0.56 5.87±0.711）4.06±0.621）2）6.55±0.701）2）3）6.02±0.511）3）4）Spleen index 4.93±0.40 2.24±0.391）2.95±0.381）2）1.80±0.271）2）3）2.07±0.301）3）4）

2.5 肺 組 織EFhD2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較 肺組織EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；JAK2、STAT3蛋白相對表達量組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組相比，模 型組、sh-EFhD2組、EFhD2組及EFhD2-AG490組EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量均升高，且EFhD2組＞EFhD2-AG490組＞模型組＞sh-EFhD2組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 肺組織EFhD2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達情況（±s，n=5）Fig.2 Lung tissue EFhD2，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein expressions（±s，n=5）

3 討論

肺癌發病因素較多，與年齡、環境暴露或腫瘤家族史等因素關系密切，隨著我國肺癌發病率和病死率的升高，對人們的健康危害逐漸加大，肺癌已被列為我國重點防治的癌癥之一［7-8］。近年來，盡管手術及放化療綜合治療手段已有長足進步，肺癌治療成功率有所提升，但仍有部分患者長期預后不佳，尋找新的治療靶點有重要臨床意義。動物實驗研究表明，注射過表達EFhD2的黑色素瘤B16F10細胞小鼠肺結節數量和大小較對照組增多，而注射低表達EFhD2基因的B16F10細胞小鼠肺結節數量和大小較對照組顯著減少［9］，提示EFhD2基因下調有助于抗腫瘤，但對EFhD2在抗腫瘤過程中作用的機制研究尚少。

本研究顯示，模型組支氣管黏膜上皮細胞磷狀化生，伴有較多炎癥細胞浸潤，模型組外周血CD3+、CD4+占比、CD4+/CD8+及脾臟指數較對照組降低，CD8+占比及肺指數升高（P＜0.05），說明大鼠肺癌建模成功，且存在明顯免疫功能紊亂現象。本研究分別應用低表達和過表達EFhD2的重組腺病毒載體干預后，sh-EFhD2組外周血CD3+、CD4+占比、CD4+/CD8+及脾臟指數升高，CD8+占比及肺指數降低（P＜0.05），而EFhD2組上述指標較模型組更為嚴重，說明低表達EFhD2可有效改善肺癌大鼠機體免疫功能。機體免疫反應的激活受體或抑制受體對體內外信號均有反應，免疫細胞通過調控大量基因表達，導致細胞因子、組織重塑酶等大量表達［10-11］。研究顯示，EFhD2在單核細胞系、小膠質細胞等細胞中均有表達，外源性刺激單核細胞可增強其抗原遞呈能力，進而增強CD8+免疫應答反應［12］。KIM等［13］研究顯示，多種免疫細胞中，EFhD2在CD8+T細胞中表達量最高，EFhD2可能通過調節抗原激發T細胞活化的晚期發揮免疫調控作用。

本研究顯示，模型組大鼠肺組織EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量均升高，提示肺癌大鼠JAK2/STAT3信號通路激活，與WANG等［14］的研究結果一致。本研究進一步應用低表達和過表達EFhD2的重組腺病毒載體干預后，sh-EFhD2組EFhD2、p-JAK2、p-STAT3蛋白降低，EFhD2組較模型組更高（P＜0.05），提示抑制EFhD2表達可抑制JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化激活；而應用JAK2通路抑制劑AG490干預后，EFhD2及JAK2/STAT3信號通路較EFhD2組降低，且機體免疫功能得到改善，提示EFhd2可能通過JAK2/STAT3信號通路發揮調控機體免疫功能的作用。JAK/STAT信號通路在多種腫瘤中被激活，參與腫瘤發生、發展等生物學過程，是目前研究的熱點腫瘤信號傳導通路［15-16］。研究表明，JAK/STAT信號通路與癌細胞免疫逃避關系密切，STAT高表達可抑制機體免疫系統對癌細胞的應答，從而介導機體先天性或獲得性免疫反應［17-18］。LIU等［19］研究表明，抑制JAK2/STAT3信號通路可通過降低腫瘤微環境中的髓源性抑制細胞抑制癌細胞免疫逃逸作用，從而減少腫瘤血管生成，發揮抗腫瘤作用。上述研究均說明JAK2/STAT3信號通路在介導腫瘤免疫逃逸過程中發揮重要作用。ZHANG等［20］研究顯示，EFhD2可通過調節巨噬細胞γ-干擾素受體的表達調控JAK2/STAT3信號通路的激活，從而在膿毒癥巨噬細胞免疫反應中發揮調控作用，與本研究中EFhD2參與肺癌大鼠免疫功能的調控機制相符，而本研究進一步采用JAK2通路抑制劑開展挽回實驗，驗證了本研究的結論，提示EFhD2可能通過JAK2/STAT3信號通路發揮調控機體免疫功能的作用。

綜上所述，抑制EFhD2蛋白表達可增強肺癌大鼠T淋巴細胞免疫功能，可能通過抑制JAK2、STAT3蛋白磷酸化發揮調控作用，為臨床中肺癌細胞免疫反應的調節提供了潛在的治療靶點。