自噬在腫瘤壞死因子-α誘導成骨細胞凋亡中的作用

史方富,崔紅旺,孫 博

成骨細胞與破骨細胞的平衡維持著人體正常的骨量，成骨細胞形成缺陷或者異常凋亡將會引起骨質疏松等一系列疾病[1]。炎癥因子在導致骨質疏松中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 是經(jīng)典的多效促炎性細胞因子，其表達水平與骨損傷呈正相關[2]，實驗研究[3]發(fā)現(xiàn),TNF-α可以誘導成骨細胞凋亡。自噬是機體內的一種自我修復程序，可以清除受損的細胞器，維持細胞的穩(wěn)態(tài)，成骨細胞、骨細胞和破骨細胞的自噬在維持骨穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用，自噬活性降低會加速細胞凋亡[4]。本研究觀察小鼠MC3T3-E1成骨細胞株的自噬在TNF-α誘導成骨細胞凋亡中的作用，為治療骨質疏松尋找潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、試劑和儀器小鼠MC3T3-E1成骨細胞株購自中國科學院上海細胞庫。TNF-α、雷帕霉素(RAP)、四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自Sigma-Aldrich公司，DMEM-F12 培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司，微管相關蛋白Ⅰ/Ⅱ輕鏈3(LC3-Ⅰ/Ⅱ)抗體、內參GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記二抗購于Cell Signaling公司，聚氟乙烯膜購于Millipore公司。細胞培養(yǎng)箱購自SANYO公司，Elx800 全波長酶標儀購自Bio Tek公司，流式細胞儀購自BD Biosciences公司。

1.2 細胞培養(yǎng)以及實驗分組MC3T3-E1成骨細胞株接種于DMEM-F12培養(yǎng)基(含10% FBS+1%青霉素/鏈霉素)，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度約達到80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，得到培養(yǎng)液。參考文獻[5]方法進行分組：① 對照組——培養(yǎng)液不做處理；② TNF-α觀察組——培養(yǎng)液中加入40 μg/L TNF-α；③ RAP觀察組——培養(yǎng)液中加入100 nmol/L RAP作用1 h后再加入40 μg/L TNF-α。

1.3 MC3T3-E1成骨細胞增殖活力的MTT法檢測將3組細胞接種于96孔板中，每孔3×103個細胞，按照1.2項分組處理后培養(yǎng)68 h，然后每孔加入0.5 μg/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，加入二甲基亞砜，酶標儀470 nm處檢測吸光度的變化，計算細胞增殖抑制率=(1-觀察組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 MC3T3-E1成骨細胞的凋亡檢測將3組細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，按照1.2項分組處理后培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化收集各組MC3T3-E1細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書加入膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)，染色30 min后，流式細胞儀檢測凋亡細胞(Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+細胞)的占比。

1.5 MC3T3-E1成骨細胞蛋白表達的免疫印跡法(Western Blot)檢測將3組細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，按照1.2項分組處理后培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化收集各組MC3T3-E1成骨細胞，加入蛋白裂解液，每組取10 μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉印至聚氟乙烯膜。10%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗，化學發(fā)光反應后，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)掃描并進行定量分析。對照內參計算LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的相對表達水平，計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平的比值。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 自噬對TNF-α誘導MC3T3-E1成骨細胞增殖和凋亡的影響見表1和圖1。MC3T3-E1成骨細胞增殖抑制率、細胞凋亡率：3組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)； TNF-α觀察組、RAP觀察組均明顯高于對照組(P<0.01)；TNF-α觀察組明顯高于RAP觀察組(P<0.01)。

表1 3組MC3T3-E1成骨細胞增殖抑制率和凋亡率的比較

圖1 3組MC3T3-E1成骨細胞凋亡的檢測

2.2 自噬在TNF-α誘導MC3T3-E1成骨細胞損傷中的變化見圖2、3。MC3T3-E1成骨細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值：對照組、TNF-α觀察組和RAP觀察組分別為0.10～0.50(0.22±0.07)、0.03～0.14(0.09±0.02)和0.96～1.52(1.25±0.26)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=24.824，P<0.001)；RAP觀察組明顯高于對照組和TNF-α觀察組(P<0.01)；TNF-α觀察組明顯低于對照組(P<0.01)。

圖2 自噬蛋白的Western Blot檢測

圖3 3組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比較 與對照組比較：**P<0.01；與TNF-α觀察組比較：##P<0.01

3 討論

隨著我國人口老齡化的進程，骨質疏松癥已成為中老年人骨痛、骨折的主要原因，抗骨吸收是采用雌激素、二膦酸鹽類藥物治療骨質疏松的主要用藥目的，但其治療效果欠佳，尋找骨質疏松癥的潛在治療靶點仍然是近幾年來研究者們關注的重點[6]。研究[7-8]顯示，促炎性細胞因子在骨代謝中起重要作用，TNF-α是炎癥通路中的一個關鍵促炎性細胞因子。臨床流行病學調查和動物實驗研究均顯示，TNF-α表達升高與骨質疏松密切相關，而且TNF-α可以抑制骨髓干細胞向成骨細胞分化[9-10]，從而激活核因子-κB信號通路誘導破骨細胞形成[11]。本研究中，TNF-α可以明顯抑制小鼠MC3T3-E1成骨細胞增殖和促進成骨細胞凋亡。研究[12]發(fā)現(xiàn)骨質疏松患者處于自噬抑制狀態(tài)，這被認為是骨質疏松發(fā)病的一種新機制，自噬體的形成是自噬激活的標志，LC3-Ⅱ是自噬體的關鍵組成蛋白，自噬發(fā)生時大量 LC3-Ⅰ水解成LC3-Ⅱ，實驗中常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達的比值反映細胞自噬激活的程度。薛凱文 等[13]的研究顯示,成骨細胞自噬通路被激活后，TNF-α的表達也會顯著降低。本研究中，TNF-α觀察組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著低于對照組，說明MC3T3-E1成骨細胞經(jīng)TNF-α處理后，抑制了自噬；對MC3T3-E1成骨細胞增殖抑制和凋亡的分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α觀察組細胞抑制率和凋亡率均顯著高于對照組，說明TNF-α抑制自噬后，MC3T3-E1成骨細胞生長得到抑制，細胞凋亡增加。為了驗證這一結果的可靠性，使用自噬激動劑RAP干預后，RAP觀察組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著高于TNF-α觀察組，說明自噬顯著激活；RAP觀察組細胞增殖抑制率和凋亡率顯著低于TNF-α觀察組，說明拮抗TNF-α可明顯增強MC3T3-E1成骨細胞自噬，進一步顯著降低TNF-α對成骨細胞的損傷。

綜上所述，自噬在TNF-α誘導MC3T3-E1成骨細胞凋亡中發(fā)揮一定作用，增強自噬可以顯著降低TNF-α對成骨細胞的損傷。