菌株Pseudomonas sp. FA4對4-氟苯胺的降解性能及其生物膜形成特性

陳 諾，趙芝清，鄭夢婷，雷宇芬，沈駱秦，吳燕君

（衢州學院 化學與材料工程學院，浙江 衢州 324000）

有機氟化物因其優異的性能廣泛應用于制藥、印染、化工、軍事等領域［1-2］。然而，除了自然界存在的五十幾種外，有機氟化物大多為人工合成，屬于難生物降解化合物，在水體、土壤、大氣中均有所累積，且具有“三致”性［3-5］。目前，含氟化合物的有效處理已成為研究的熱點和難點。迄今為止，相關學者已報道了化學法［6］、物理法［7］和生物法［8］等含氟化合物處理方法。其中，生物法因其處理成本低、不易產生二次污染等優點備受青睞。生物強化技術是指向生物處理系統中引入具有特定降解功能的微生物，提高有效微生物的濃度，從而改善原有生物處理體系的廢水處理效果［9］。近年來，相關學者已從環境中分離得到了多株有機氟化物高效降解菌［10-12］。生物強化技術成敗的關鍵是降解功能菌株能否快速定植，而生物膜的形成對菌株的定植具有重要影響。生物膜形成過程中，除受微生物自身一些內在機制調控外［13-14］，還受水質條件和水力條件等影響，如pH、鹽度和重金屬等［15］，而當前有關此方面的研究甚少。

本研究以前期篩選得到的一株4-氟苯胺（4-FA）高效降解菌——假單胞菌FA4（Pseudomonassp. FA4）為研究對象，重點考察了pH、重金屬等環境因子對其降解性能和生物膜形成的影響，以期為調控該菌株在實際廢水處理中的應用提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

所用試劑均為國產分析純。

4-FA高效降解菌：本課題組前期篩選得到的假單胞菌（Pseudomonassp.），命名為菌株FA4。

培養基：4-FA0.5 g/L，Na2HPO4·2H2O 2.7 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，MgCl20.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，CaCl20.01 g/L，酵母提取物 0.02 g/L，微量元素溶液Ⅰ和溶液Ⅱ［16］各1.0 mL/L，pH 7.2。121 ℃高壓滅菌30 min。固體培養基中瓊脂含量為15～20 g/L，半固體培養基中瓊脂含量為5～8 g/L。

Waters高效液相色譜儀：2487型雙波長紫外檢測器，717型自動進樣器，沃特世科技（上海）有限公司；Amethyst C18型色譜柱：4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm，蘇州賽分科技有限公司；722N型可見光分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；Sigma 1-13型離心機：德國Sigma實驗室離心機股份有限公司。

1.2 菌株FA4降解能力的影響

設置不同環境因子（4-FA初始質量濃度、pH、重金屬種類），考察菌株FA4降解能力的變化：1） 按10%的接種量將600 nm處吸光度（OD600）約為0.5的菌液分別接種至含100～2 400 mg/L 4-FA的培養基中，以30 ℃、120 r/min振蕩培養3～4 d后，取樣測定4-FA和氟離子的質量濃度、溶液OD600以及1，2-雙加氧酶和2，3-雙加氧酶的酶活；2）用濃度為1.0 mol/L的HCl和NaOH 溶液分別調整培養基pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10，接種振蕩培養3～4 d后取樣分析；3）分別稱取一定量的重鉻酸鉀、氯化鎳、氯化銅和氯化鋅至培養基中，使Cr（Ⅵ）、Ni2+、Zn2+和Cu2+的質量濃度均為10 mg/L，接種振蕩培養3～4 d后取樣分析，同時設置不投加金屬離子的對照組，記為CK。

1.3 生物膜形成的影響

基于實際廢水組分，重點考察了pH、金屬離子種類和NaCl質量濃度對菌株FA4生物膜形成的影響，具體條件如下：1）用HCl和NaOH溶液分別將培養基pH調至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，分別取2 mL培養基裝至18支φ10 mm×75 mm試管中，在接種量10%、30 ℃、120 r/min條件下接種、振蕩培養3～4 d；2）向培養基中添加不同質量濃度的Cu2+、Zn2+、Cr（Ⅵ）和Ni2+，設置0，1，5，10，20 mg/L 5個水平，培養條件同上；3）向培養基中添加不同質量的NaCl，使NaCl的質量分數分別為0，0.10%，0.25%，0.50%，1.00%，2.00%，培養條件同上。培養完成后測定生物膜形成量，每個水平設置3個平行試樣。

1.4 細菌群游能力的影響

分別配制不同pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0）、不同NaCl質量濃度（0，0.10%，0.25%，0.50%，1.00%）和分別含10 mg/L金屬離子（Cu2+、Zn2+、Cr（Ⅵ）和Ni2+）的半固體培養基，接種OD600約為0.5的菌液1 μL，30 ℃培養3～4 d后測定細菌群游直徑［17］。每個水平設置3個平行試樣。

1.5 分析方法

4-FA的質量濃度采用高效液相色譜法測定［16］：水樣經12 000 r/min離心5 min并經過0.22 μm水系濾膜過濾；流動相為甲醇-水溶液（體積比7∶3），柱溫 35 ℃，檢測波長為230 nm。

1，2-雙加氧酶和2，3-雙加氧酶的酶活測定方法見文獻［16］；氟離子質量濃度的測定采用氟離子電極法［18］；OD600的測定采用可見光分光光度法。

生物膜形成量的測定采用結晶紫染色法［17］：試管管壁上的生物膜以結晶紫染色后再用乙醇-丙酮溶液（體積比80∶20）洗脫，測定洗脫液在波長570 nm處的吸光度（OD570），以OD570表征生物膜形成量。

2 結果與討論

2.1 不同因子對菌株降解4-FA、脫氟及生長的影響

2.1.1 初始濃度

4-FA初始濃度對菌株FA4降解能力的影響見圖1。由圖1可知：菌株FA4可有效降解初始質量濃度為100～2 400 mg/L的4-FA，去除率維持在90.00%以上；隨4-FA初始質量濃度的增大，脫氟率由80.00%左右降至42.90%（最高80.60%），OD600則先由0.139升至0.763再降至0.696。SONG等［8］報道4-FA降解菌株羅爾斯通氏菌（Ralstoniasp.）FD-1的最高可降解質量濃度為1 500 mg/L，故菌株FA4具有良好的降解能力。

圖1 4-FA初始質量濃度對菌株FA4降解能力的影響

采用質量濃度為500 mg/L的4-FA培養3 d后，測定菌液的酶活。結果顯示，菌液的1，2-雙加氧酶的酶活為（0.027 0±0.002 5）μmol/（mg·min）（以每mg蛋白計），2，3-雙加氧酶的酶活基本未檢測到。由此可推測，4-FA主要通過鄰位開環實現轉化降解。

2.1.2 金屬離子種類

不同金屬離子的種類和濃度會對生化處理系統產生不同的毒性。WANG等［19］研究發現，5 mg/L的Ni2+對生化系統的TOC去除率影響不大，而當質量濃度升至10 mg/L時則呈現明顯的抑制。CHENG等［20］報道，5 mg/L的Cr（Ⅵ）即可使生化處理系統的基質去除率急劇下降。鮑雪飛［21］研究發現，9 mg/L的Cu2+可使生物系統的COD去降率下降54.11%。鑒于此，重點考察了10 mg/L的Ni2+、Zn2+、Cu2+和Cr（Ⅵ）對菌株降解能力的影響。在質量濃度均為10 mg/L的條件下，金屬離子種類對菌株FA4降解能力的影響見圖2。由圖2可知：相比CK，10 mg/L Ni2+和Cr（Ⅵ）均對4-FA去除率無較大影響；Zn2+對脫氟過程呈現了促進作用；而Cu2+則呈現了較為明顯的抑制作用，4-FA去除率從100%降至53.44%，脫氟率則由76.82%降至3.44%。可見，菌株FA4對Ni2+、Zn2+和Cr（Ⅵ）具有良好的耐受能力。另一方面，在Ni2+、Zn2+、Cu2+和Cr（Ⅵ）存在下，相比CK，OD600均有所增加，分別由0.250增至0.286、0.305、0.407和0.333。金屬離子環境下，為了保護細胞免受侵害，微生物通常會分泌出更多的胞外聚合物（EPS），從而影響了OD600的測定。

圖2 金屬離子種類對菌株FA4降解能力的影響

2.1.3 pH

pH對菌株FA4降解能力的影響見圖3。由圖3可見：當pH為6.0～10.0時，4-FA去除率基本維持在99%以上，脫氟率則隨著pH增大而先增加后減小，于pH=7.0時達到最大（90.00%）；當pH=6.0時，4-FA去除率、脫氟率和OD600分別為99.67%、65.63%和0.162；而當pH降至5.0時，4-FA去除率、脫氟率和OD600分別降至53.72%、5.51%和0.093。這說明菌株FA4更適宜在中性的環境中生長。

圖3 pH對菌株FA4降解能力的影響

2.2 不同因子對菌株FA4生物膜形成的影響

生物膜是細菌細胞在受到pH、鹽度等環境因子的刺激或誘導后，發展出的一種具有“應激”特征的集體生長形態［22-23］，其形成過程因細菌的種類而異。

2.2.1 pH

pH對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖4。由圖4可見，當pH由5.0升至10.0時，OD570先增大后減少，當pH為7.0時達到最大（0.236），pH為6.0和8.0時次之，基本與降解特性變化趨勢一致（見圖3）。表明中性環境更有利于生物膜的形成，偏酸或偏堿的環境不利于生物膜的形成。

圖4 pH對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

2.2.2 NaCl質量分數

NaCl質量分數對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖5。

圖5 NaCl質量分數對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

由圖5可見：當NaCl質量分數為0～0.25%時，OD570約為0.203，隨著NaCl質量分數的增加OD570基本保持不變，可能是因為低濃度NaCl對菌的生長無影響，沒有激發菌株的“應激”響應體系；當NaCl質量分數進一步提升至0.50%和1.00%時，OD570分別為0.267和0.296，表明生物膜形成量明顯增大，可能是因為菌株在脅迫條件下啟動了“應激”自我保護，分泌了較多的EPS，從而提高了生物膜形成量；而當NaCl質量分數繼續增加到2.00%時，OD570約為0.219，表明生物膜形成量顯著下降，可能是由于NaCl質量分數過高導致脫氫酶失活，菌體無法分泌更多的EPS進行自我保護。張蘭河等［24］研究發現，NaCl質量分數小于0.5%時微生物產生的EPS相對穩定，而當NaCl質量分數大于0.5%時，EPS也快速增多，以抵抗滲透壓升高對細胞的破壞。可見，NaCl質量分數為0.50%～1.00%的生長環境有利于菌株FA4生物膜的形成，這也與熊富忠等［15］的研究結論基本一致。

2.2.3 重金屬種類及濃度

重金屬種類及濃度對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖6。由圖6可見：Cu2+，Zn2+，Cr（Ⅵ）質量濃度為0～20 mg/L時，Cu2+，Zn2+，Cr（Ⅵ）對OD570均未有明顯的影響；未添加Ni2+培養時的OD570為0.269，添加1，5，10，20 mg/L的Ni2+后的OD570分別為0.325，0.509，0.450，0.476，經差異性分析發現，5～20 mg/L的Ni2+對生物膜形成具有促進作用，與相關報道一致［25］。因此，投加5～20 mg/L的Ni2+有利于促進菌株FA4生物膜的形成。

圖6 重金屬種類及濃度對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

2.3 菌株FA4的群游能力

具有強運動能力的細菌通常能快速與材料表面發生初始黏附，繼而增殖、擴張，形成生物膜［26］。不同環境因子條件下菌株FA4的群游直徑見圖7。由圖7a可見，當pH由5.0升至10.0時，群游直徑先增大后減少，其中當pH為7.0時達到最大，為5 mm。由圖7b可見，當NaCl質量分數為0.10%～1.00%時，群游能力與NaCl質量分數為0時基本相當，維持在4～5 mm，而當NaCl質量分數繼續增加到2.00%時，群游能力則顯著減小，僅為3 mm。由圖7c可見，相比CK，10 mg/L的 Cu2+和Cr（Ⅵ）使菌株FA4的群游能力有所降低，而Zn2+和Ni2+對群游能力的影響不明顯。該結果基本與2.23節的結論相一致。

圖7 不同環境因子條件下菌株FA4的群游直徑

3 結論

a）菌株FA4能有效降解質量濃度為100～2 400 mg/L的4-FA，4-FA去除率維持在90.00%以上，脫氟率為42.90%～80.60%。菌株FA4最適生長pH為7.0，對10 mg/L 的Ni2+、Zn2+和Cr（Ⅵ）具有良好的耐受能力。

b）菌株FA4生物膜形成的最適條件為pH=7.0、NaCl質量分數0.50%～1.00%，投加5～20 mg/L的Ni2+可促進菌株FA4生物膜的形成。

c）就菌株FA4群游能力而言，最適條件為pH=7.0、NaCl質量分數0 ～1.00%，10 mg/L的Zn2+和Ni2+均未對菌株FA4群游能力產生明顯影響。